基于巨噬细胞模型的竹荪多糖的免疫功能

尚京迎， 付海田， 邓 超， 张斯秀， 陈敬华*

（1.江南大学 药学院，江苏 无锡214122；2.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡214122）

基于巨噬细胞模型的竹荪多糖的免疫功能

尚京迎1， 付海田1， 邓 超2， 张斯秀2， 陈敬华1*

（1.江南大学 药学院，江苏 无锡214122；2.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡214122）

为探索竹荪多糖（DI）对巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响，分别采用四唑氮蓝（MTT）法、中性红法、Griess法、ELISA法，检测DI对巨噬细胞增殖、吞噬活性、一氧化氮（NO）和白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、α肿瘤坏死因子（TNF-α）分泌量的影响；运用反转录PCR （RT-PCR）检测iNOS和IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表达量的变化。结果表明，在25～200 μg/mL质量浓度范围内，DI能够明显促进巨噬细胞增殖，增强其吞噬活性。同时，DI能够增强巨噬细胞分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α的能力，且明显提高iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达水平。因此，竹荪多糖对巨噬细胞RAW264.7具有免疫刺激作用。

多糖；竹荪；巨噬细胞；免疫功能

竹荪（Dictyophora indusiata）是一类大型真菌，属 于 真 菌 门 （Eumycota）、 担 子 菌 亚 门（Basidiomycotina）、腹菌纲（Gasteromycetes）、鬼笔目（Phallales）、 鬼 笔 科 （Phallacefte）、 竹 荪 属（Dictyophora），其香味浓郁，滋味鲜美，营养丰富，是当今世界上名贵的食用菌之一，具有滋补强壮、宁神健体、益气补脑、润肺止咳、补气养阴及清热利湿等功效［1-2］。

竹荪多糖是长裙竹荪的主要活性物质。关于竹荪多糖的研究，国内外主要集中在多糖的提取方法和结构解析上［3-6］，对竹荪多糖的药理研究较少。已有部分报道证明，竹荪多糖具有抗肿瘤、抗氧化等作用［3，7-8］。本文中以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为模型，研讨竹荪多糖对RAW264.7细胞增殖、吞噬活性，以及 NO、IL-1、IL-6、TNF-α的分泌及iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达的影响，旨在探究竹荪多糖的免疫调节功能，为充分开发应用竹荪提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 细胞 小鼠巨噬细胞株RAW264.7，购自中国科学院上海细胞库，培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中，每天换液，隔2 d传代1次，细胞长至对数生长期时，按不同实验目的处理。

1.1.2 试剂 DMEM高糖培养基，美国Gibco公司产品；胎牛血清，美国Hyclone公司产品；脂多糖（LPS）、MTT，美国Sigma公司产品；ELISA试剂盒，美国R&D公司产品；RNA提取及纯化试剂盒，美国Invitrogen公司产品；cDNA逆转录试剂盒，美国Fermenta公司产品；PCR酶，宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.3 竹荪多糖 竹荪子实体购自四川省长宁县，经水提醇沉后得粗多糖，再以sevage法脱蛋白质，除杂后冷冻干燥得到实验用的竹荪多糖。经苯酚硫酸法检测其总糖质量分数为93.6%，考马斯亮蓝法测定蛋白质质量分数为5.73%。将10 mg竹荪多糖溶于10 mL细胞培养液，过滤除菌，－20℃分装保存。

1.1.4 仪器与设备 Multiskan GO酶标仪、CO2细胞培养箱，美国Thermo公司制造；倒置荧光显微镜，德国Leica公司制造；凝胶成像系统、PCR仪，美国Bio-Rad公司制造；精密电子天平，美国Mettler Toledo公司制造；RE52-99旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂制造；紫外可见分光光度计，日本日立仪器有限公司制造；FreeZone2.5L冷冻干燥机，美国Labconco公司制造。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测竹荪多糖对RAW264.7细胞增殖的影响 取对数生长期的细胞以5×103/孔接种于96孔培养板，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育6 h。加入 200 μL不同质量浓度 （25、50、100、200 μg/ mL）的竹荪多糖干预，同体积的1 μg/mL LPS为阳性对照组，同体积的完全培养液为空白对照组，设4个复孔，继续孵育48 h，然后加入10 μL MTT（5 g/ L）再孵育4 h，离心5 min（3 000 r/min），弃上清液，每孔加100 μL DMSO，避光轻振10 min，酶标仪570 nm检测OD值［9］。

1.2.2 中性红法检测竹荪多糖对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 取对数生长期细胞以3×104/孔接种于96孔培养板，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育24 h。实验组、空白对照组、阳性对照组处理同1.2.1，48 h后弃上清液，每孔加入100 μL质量分数为0.072%的中性红溶液，继续孵育30 min，弃中性红，用预温的PBS缓冲液洗3遍，每次200 μL，甩干。然后加入冰醋酸-无水乙醇（体积比1∶1）细胞溶解液100 μL/孔，4℃放置2 h，酶标仪550 nm检测OD值［10］。

1.2.3 Griess法检测竹荪多糖对RAW264.7分泌NO的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，以5×104/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育6 h。实验组、空白对照组、阳性对照组处理同 1.2.1，48 h后取上清液，按照Griess试剂盒说明书操作方法检测NO的生成［10］。

1.2.4 ELISA法检测竹荪多糖对RAW264.7分泌细胞因子的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，以5×104/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育6 h。实验组、空白对照组、阳性对照组处理同 1.2.1，48 h后取上清液，用ELISA试剂盒测定IL-1、IL-6和TNF-α含量，具体操作方法参照试剂盒说明书，酶标仪450 nm检测OD值［9］。

1.2.5 RT-PCR法检测细胞因子mRNA的表达 取对数生长期RAW264.7细胞，以5×105/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育12 h。实验组、空白对照组、阳性对照组处理同1.2.1，48 h后吸去上清液，用TRIzol收集细胞，按照试剂说明提取总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，然后总RNA逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增。基因引物序列见表1，35个循环扩增，得到的扩增产物进行1.5 g/dL的琼脂糖凝胶电泳，Image Lab软件分析［11］。

表1 基因引物序列Table1 List of primers used in polymerase chain reactions

1.2.6 统计学分析 统计学处理结果以平均数±标准误差表示，采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析进行显著性检验，组间的两两比较采用LSD法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 竹荪多糖对RAW264.7增殖的影响

巨噬细胞发挥免疫功能的基础是细胞的存活，存活的状态直接影响其功能的发挥及应答的强弱［12］。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲臜，而死细胞却无此功能。在一定细胞数量范围内，甲臜结晶形成的量与活细胞数量成正比，因此，通过测定反应后的吸光度可以判断活细胞的数量，也能在一定程度上反映细胞的活性能力。由图1可知，在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖实验组吸光度与空白对照组相比较均有显著性差异 （P＜0.01），与阳性对照组相比较均无显著性差异 （P＞0.05），说明竹荪多糖在25～200 μg/mL质量浓度范围内具有促进巨噬细胞增殖的活性，无细胞毒性。

2.2 竹荪多糖对RAW264.7吞噬活性的影响

吞噬是巨噬细胞发挥其免疫作用的重要方式之一，巨噬细胞通过吞噬侵入的病原体和体内衰老、畸变的细胞而提高机体的抗感染能力［12］。中性红吞噬实验结果见图2。

图1 竹荪多糖对RAW264.7增殖的影响Fig.1 DI induced proliferation of RAW264.7 cells

图2 竹荪多糖对RAW264.7吞噬活性的影响Fig.2 Effects of DI on phagocytosis of RAW264.7 cells

在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖实验组对RAW264.7细胞吞噬活性的影响明显高于空白对照组（P＜0.01），且吞噬活性随干预浓度的增加而增强；竹荪多糖质量浓度为200 μg/mL时，其对RAW264.7吞噬功能的促进作用与阳性对照组相比较无显著性差异 （P＞0.05）。表明在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖对RAW264.7细胞吞噬活性具有增强作用，且具有浓度依赖性。提示竹荪多糖对巨噬细胞的吞噬能力有上调作用，增强了巨噬细胞吞噬病原微生物的非特异性免疫反应能力。

2.3 竹荪多糖对NO分泌量的影响

NO是激活的巨噬细胞杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，广泛参与机体多种生理及病理过程，其可通过作为信使分子以及发挥自身的细胞毒性效应这两方面的作用来实现巨噬细胞免疫功能的增强［13］。根据Griess法，得到OD540（y）与NO2-浓度（x）的标准方程为

测定样品的OD540值，通过标准方程计算NO2-的浓度。图3结果显示：当竹荪多糖质量浓度为25～200 μg/mL时，与空白对照组相比，实验组均能够极显著地增强巨噬细胞分泌NO的能力（P＜0.001）；当竹荪多糖质量浓度为200 μg/mL时，巨噬细胞分泌NO量最高，接近于阳性对照组（P＞0.05）。表明在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖能激活巨噬细胞，提高其分泌NO的能力。适量NO的分泌是炎症反应初期机体对抗炎症的积极表现，从而实现机体免疫力的提高。

图3 竹荪多糖对NO分泌量的影响Fig.3 Effects of DI on NO production in RAW264.7 cells

2.4 竹荪多糖对细胞因子分泌量的影响

当机体受外界因素刺激后，活化的巨噬细胞作为主要的非特异性免疫效应细胞，能够产生多种细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）参与免疫系统的调节，进一步启动特异性免疫反应，促进T、B淋巴细胞的增殖分化，增强NK细胞的杀伤功能，刺激免疫调节介质和炎症介质的表达［14］。因此，通过考察多糖干预后巨噬细胞相关细胞因子的分泌情况，可以了解巨噬细胞的活化程度。

由图4可知，当质量浓度为25～200 μg/mL时，竹荪多糖显著性促进巨噬细胞分泌IL-1（P＜0.001）；当质量浓度为200 μg/mL时，竹荪多糖刺激巨噬细胞分泌 IL-1的量达到99.07 ng/L，与阳性对照组（98.05 ng/L）相比无显著性差异（P＞0.05）。说明在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖能激活巨噬细胞，提高其分泌细胞因子IL-1的能力。

图4 竹荪多糖对IL-1分泌量的影响Fig.4 Effects of DI on IL-1 production in RAW264.7 cells

由图5可知，当质量浓度为25～200 μg/mL时，竹荪多糖显著促进巨噬细胞分泌IL-6（P＜0.001），并且随干预浓度的增加，IL-6分泌量增多 （P＜0.05）；当质量浓度为100 μg/mL时，竹荪多糖刺激巨噬细胞分泌IL-6的量达到102.11 pg/mL，与阳性对照组（104.79 pg/mL）相比无明显差异（P＞0.05）。说明在25～200 μg/mL质量浓度范围内，竹荪多糖能激活巨噬细胞，提高其分泌细胞因子IL-6的能力，且呈浓度依赖性。

图5 竹荪多糖对IL-6分泌量的影响Fig.5 Effects of DI on IL-6 production in RAW264.7 cells

由图6可知，当质量浓度为25～200 μg/mL时，竹荪多糖显著促进巨噬细胞分泌TNF-α（P＜0.001）；当质量浓度为100 μg/mL时，竹荪多糖刺激巨噬细胞分泌TNF-α的量达到758.03 ng/L，与阳性对照组的786.17 ng/L比较无明显差异（P>0.05）。说明竹荪多糖可激活巨噬细胞，刺激TNF-α的分泌。

2.5 细胞因子mRNA的表达

mRNA是基因与表达产物间的桥梁，大部分蛋白质表达水平和mRNA转录水平具有相关性。在多糖的干预下，巨噬细胞相关细胞因子mRNA表达的增强是提高其细胞因子分泌量的原因之一［15］。βactin是管家型基因，在所有组织中的表达相对持续稳定。本实验以β-actin作为内参，运用RT-PCR技术考察了巨噬细胞相关细胞因子mRNA的表达情况。结果如图7所示。

图6 竹荪多糖对TNF-α分泌量的影响Fig.6 Effects of DI on TNF-α production in RAW264.7 cells

图7 细胞因子mRNA的表达Fig.7 Effects of DI on cytokine gene expression by RAW264.7 cells

β-actin各组间条带亮度相似，说明提取的总RNA量无显著性差异；与空白对照组比较，不同质量浓度的竹荪多糖干预巨噬细胞后iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达量都有不同程度的升高；当竹荪多糖质量浓度为25 μg/mL时，IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达量均较低；当竹荪多糖质量浓度为200 μg/mL时，iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α的条带亮度均与阳性对照组相似；巨噬细胞iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达量变化趋势与其分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α的量相关，推测竹荪多糖可能通过在转录水平上调节iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达，从而实现巨噬细胞NO、IL-1、IL-6、TNF-α分泌的增加。

3 讨论

巨噬细胞是具有多种功能的免疫效应细胞，能够分泌促炎症细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等，并且对病原微生物及癌细胞表现出较高的吞噬能力，在机体先天性免疫系统中发挥重要作用。TNF-α是由多种活化的免疫和非免疫细胞产生的促炎症细胞因子，是特异性免疫应答和炎症反应之间的重要连接纽带，在宿主防御机制中发挥重要的作用，可以直接杀伤肿瘤细胞，并且能够刺激一系列免疫调节介质和炎症介质的表达［14］。IL-6是一种多功能细胞因子，可以促进T、B细胞的增殖分化，促进B细胞的终末分化及分泌抗体［16］。巨噬细胞受刺激活化时，释放的大量NO具有细胞毒作用，可杀伤肿瘤细胞，也可以诱发炎症反应保护机体抵御外界不利因素的侵害［17］。IL-1是活化巨噬细胞分泌的重要细胞因子，不仅能够促进B淋巴细胞分泌IL-12，而且能够增强NK细胞的杀伤功能［18］。

作者所在实验室前期采用热水浸提获得的竹荪子实体多糖为三螺旋构象β-（1→3）-D-葡聚糖，体外无抗肿瘤细胞活性，而动物实验显示具有抑制肿瘤生长的效果［8］。由此推测竹荪多糖是否是通过免疫增强效应实现其体内抗肿瘤活性。因此，本实验以巨噬细胞为模型，研究竹荪多糖的免疫活性，结果表明：在一定质量浓度范围内，竹荪多糖能够促进巨噬细胞增殖，增强其吞噬活性，促进其分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α；与此同时，竹荪多糖还能增加巨噬细胞iNOS、IL-1、IL-6和TNF-α mRNA的表达。据此推测，竹荪多糖是通过在转录水平上调节iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达，从而实现巨噬细胞NO、IL-1、IL-6、TNF-α分泌的增加。

4 结语

作者所在实验室初步证明了竹荪多糖对巨噬细胞具有免疫调节作用，可以作为免疫调节剂应用于保健食品领域。然而，竹荪多糖激活巨噬细胞的机制仍不明了，如其与巨噬细胞表面何种受体结合，以及后续启动的信号通路有哪些等问题，需要作进一步深入研究。

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Immunomodulatory Effects of A Polysaccharide from Dictyophora indusiata on Macrophage

SHANG Jingying1， FU Haitian1， DENG Chao2， ZHANG Sixiu2， CHEN Jinghua1*
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to investigate the immunomodulatory effects of a polysaccharide from Dictyophora indusiata （DI）on the immune function of RAW264.7 cells，the effects of DI on cell proliferation，phagocytosis of RAW264.7 cells，levels of NO，IL-1，IL-6 and TNF-α production were detected by MTT assay，neutral red test，Griess method，and ELISA，respectively.The mRNA expression level of iNOS，IL-1，IL-6 and TNF-α were also measured by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）.The results indicated that DI contributed significantly to the proliferation of the macrophages and the phagocytic activity was at 25～200 μg/mL.In addition，the production of NO，IL-1，IL-6 and TNF-α in macrophages were increased.Further，the expression of iNOS，IL-1，IL-6 and TNF-α mRNA were significantly up-regulated. The DI played immunomodulatory effects on macrophage cell line RAW264.7.

polysaccharide，Dictyophora indusiata，macrophage，immunomodulation

Q 539

A

1673—1689（2016）08—0849—06

2015-01-09

教育部博士点基金项目（20110093110008）。

陈敬华（1971—），男，湖北黄石人，理学博士，教授，主要从事生物大分子和生物功能材料的研究。E-mail:jhchenwhut@126.com