前肢畸形WHBE兔血清钙、磷、碱性磷酸酶含量检测及骨密度分析

陈方明， 徐剑钦， 朱科燕， 杨钦钦， 陈民利（浙江中医药大学动物实验研究中心， 杭州 310053）

前肢畸形WHBE兔血清钙、磷、碱性磷酸酶含量检测及骨密度分析

陈方明， 徐剑钦， 朱科燕， 杨钦钦， 陈民利
（浙江中医药大学动物实验研究中心， 杭州 310053）

目的 观察前肢畸形WHBE （FMWHBE） 兔前肢生理、病理特点和血清钙（Ca）、磷（P）含量等生化特性，探讨前肢畸形的可能成因及作为骨质疏松等骨生物力学研究模型的可能性。方法 分别选取1、2、3、4月龄FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白（JPW）兔，每个月龄阶段各6只。检测所有实验兔血清钙（Ca）、磷（P）和碱性磷酸酶（ALP）含量； 用小动物成像系统X射线成像后测量前肢肱骨、桡骨、尺骨骨密度（BMD），并经HE染色后，进行病理学检查。结果 与JPW兔比较，1、2、4月龄FMWHBE兔血清Ca含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），4月龄FMWHBE兔血清P含量显著升高（P＜0.05）。FMWHBE兔血清ALP水平显著低于WHBE兔和JPW兔组（P＜0.05或P＜0.01）； 与同期正常WHBE兔比较，1～4月龄FMWHBE兔肱骨和2、3、4月龄桡骨及1、2月龄FMWHBE兔尺骨BMD均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），与同期正常JPW兔比较，1、3月龄肱骨、桡骨和1、2月龄尺骨BMD均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）； 病理学检查结果显示，与WHBE兔JPW兔比较，FMWHBE兔前肢肱骨、桡骨、尺骨骨皮质较薄，局部骨组织表面成骨细胞较少，未见整齐排列成一层，骨小管数量较少，新生骨组织较少。结论 FMWHBE兔前肢畸形可能与较低的血Ca和ALP水平导致BMD的降低以及成骨细胞减少、新生骨较少有关。

前肢畸形WHBE （FMWHBE） 兔； 骨密度（BMD）； 钙（Ca）； 磷（P）； 碱性磷酸酶（ALP）

WHBE（white hair and black eyes）兔， 是我中心从日本大耳白（JPW）兔中发现的毛色为白色、眼睛为黑色的实验兔，现已近交育成封闭群实验兔， 又名JPW兔黑眼系。WHBE兔具有高产仔率和易产生高效价抗体的免疫学特性，已在药品检测和抗体制备等生物医学领域应用。在育种生产过程中， 有部分幼年WHBE兔自发前肢畸形， 表现为前肢外展， 无法内收直立，足部无力支撑， 仅靠前肢整体着地支撑体重， 呈趴卧姿态， 且前肢桡骨、尺骨畸形， 畸形发生率约10%。本实验检测了1、2、3、4月龄的前肢畸形WHBE（FMWHBE）兔前肢肱骨、桡骨、尺骨骨密度（BMD）， 对血清钙（Ca）、磷（P）和碱性磷酸酶（ALP）水平进行检测， 并与同期JPW兔、正常WHBE兔进行对比， 探讨WHBE兔自发前肢畸形的可能成因，并为探讨FMWHBE兔是否可能成为自发性骨质疏松模型动物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

分别选取1、2、3、4月龄普通级FMWHBE兔、WHBE兔和JPW兔各6只，共72只，来源于新昌县大市聚镇欣健兔场［SCXK（浙）2009-0042］；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心 ［SYXK（浙）2008-0116］，饲料Ca、总P含量分别为1.5%、0.8%，符合GB 14924.3-2010标准，饲养室温度22±2 ℃，相对湿度50%±5%， 12 h/12 h明暗交替，光照强度150 lx。

1.2 主要仪器和试剂

日立7020全自动生化仪、Image Station小动物成像系统、STP120脱水机、AP280-2包埋机、Leica半自动切片机、Nikon eclipse 80i显微镜等。血清Ca 试剂盒，批号：18288/00001221； P试剂盒，批号: 520071/50001715； ALP试剂盒，批号: 07086/00000821，以上生化试剂均购自德赛诊断系统（上海）有限公司； 进口脱钙液，批号: 20999，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

将FMWHBE兔组、WHBE兔组和JPW兔组各月龄实验兔耳动脉取血5 mL， 以2 095×g离心10 min，分离血清，用日立7020全自动生化仪检测血清Ca、P和ALP； 用体积分数3%戊巴比妥钠1 mL/kg麻醉后处死各组实验兔，取前肢，立即用小动物成像系统X射线成像后测量肱骨、桡骨、尺骨BMD。分离前肢肌肉后用体积分数10%中性甲醛固定，快速脱钙1周后进行脱水、浸蜡、包埋、切片和HE染色。

骨质疏松判断标准：Kedak Image Station自带图像分析软件对X光成像后的前肢骨进行BMD测量。根据文献，采用同龄正常动物BMD值作为对照，以BMD统计学分析结果显著降低作为骨质疏松症的判断标准［1，2］。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 血清Ca、P和ALP水平

1、2、4月龄FMWHBE兔和WHBE兔血清Ca含量显著低于JPW兔组（P＜0.05或P＜0.01）； 4月龄FMWHBE兔和WHBE兔血清P含量显著高于同期JPW兔组（P＜0.05或P＜0.01）， 3月龄WHBE兔血清P含量显著高于FMWHBE兔和JPW兔组（P＜0.01）；4月龄FMWHBE兔Ca/P显著低于JPW兔； FMWHBE兔血清ALP水平显著低于WHBE兔和JPW兔组（P＜0.05或P＜0.01），WHBE兔和JPW兔组未见明显差异。

2.2 前肢肱骨、桡骨、尺骨BMD变化

各组实验兔BMD测量结果显示：1、2、3、4月龄FMWHBE兔肱骨BMD均显著低于WHBE兔组（P＜0.05或P＜0.01）， 1、3月龄肱骨BMD显著低于JPW兔组（P＜0.01）； 1、3月龄FMWHBE兔桡骨BMD显著低于JPW兔组（P＜0.05或P＜0.01）， 2、3、4月龄FMWHBE兔桡骨BMD显著低于WHBE兔组（P＜0.05或P＜0.01）； 1、2月龄FMWHBE兔尺骨BMD显著低于WHBE兔和JPW兔组（P＜0.01）；WHBE兔除1月龄桡骨BMD显著低于JPW兔组（P＜0.05）外，其余各月龄肱骨、桡骨、尺骨BMD未见明显差异。

表 1 各组实验兔不同月龄血清Ca、P和ALP水平Table 1 Changes of the levels of serum Ca， P and ALP in rabbits of different ages

表 2 各组实验兔不同月龄前肢肱骨、桡骨、尺骨BMD结果 g/cm2Table 2 The results of bone mineral density of fore humerus， radius and ulna in rabbits of different ages

2.2 肱骨、桡骨、尺骨病理变化

A: FMWHBE肱骨； B: FMWHBE桡骨； C: FMWHBE尺骨； D: WHBE肱骨； E: WHBE桡骨； F: WHBE尺骨；G: JPW肱骨； H: JPW桡骨； I: JPW尺骨（HE×100）图 1 一月龄实验兔前肢肱骨、桡骨、尺骨病理形态A: FMWHBE fore humerus； B: FMWHBE radius； C: FMWHBE ulna； D: WHBE fore humerus； E: WHBE radius；F: WHBE ulna； G: JPW humerus； H: JPW radius； I: JPW ulna （HE×100）Figure 1 Pathological changes of fore humerus， radius and ulna in 1 month rabbits

病理学观察发现， JPW和WHBE兔肱骨、桡骨、尺骨骨组织表面可见排列成一层的成骨细胞，可见大量骨小管和新生骨组织， 骨皮质较厚； FMWHBE兔前肢肱骨、桡骨、尺骨骨皮质较薄，局部骨组织表面成骨细胞较少， 未见整齐排列成一层，骨小管数量较少， 新生骨组织较少， 骨小梁相对较少。以上病理变化尤其以1月龄实验兔对比明显（图1）。

3 讨论

Ca是骨骼的重要组成部分，参与骨路的生长发育，有利于保持体内矿物质的平衡和骨平衡。血Ca主要以3种形式存在，即离子Ca、蛋白结合Ca和与小分子阴离子结合的Ca。离子Ca具有Ca的生理活性，约占血清总Ca的47%［3，4］。本实验在相同饲养条件下，1、2、4月龄FMWHBE兔血清Ca含量显著低于JPW组，提示FMWHBE兔BMD的降低可能与血Ca水平较低有关。P大部分存在于骨矿物质中， 不但具有维持机械强度的作用， 且以无机P的形式存在于骨中维持细胞内P的稳定［1，4］。血Ca、血P与骨骼中的Ca、P保持动态平衡，血Ca、血P含量的测定能反映出骨组织的代谢情况，而Ca、P比例的失调，P水平增高可能通过刺激甲状旁腺激素分泌增加，引发高P血症和低Ca血症，导致BMD降低［5，6］。本实验中4月龄FMWHBE兔血清P含量较高而血清Ca/P低于于同期JPW兔，提示WHBE兔前肢畸形可能存在血清Ca、P比例异常有关。ALP是参与骨代谢的重要蛋白质，主要存在于细胞的质膜， 是普遍存在的胞内酶，是临床上常见的评价骨形成和骨转换的指标之一［7］。成骨细胞的活性及成骨作用的变化与血清ALP的活性密切相关，较高ALP活性对分解磷酸酯的无机磷促进骨基质矿化具有积极作用［8］。FMWHBE兔血清ALP水平显著低于WHBE兔和JPW兔组，且FMWHBE 兔1、2、3、4月龄肱骨BMD、1、3月龄的桡骨和1、2月龄尺骨BMD显著低于JPW兔，结果提示低水平的ALP可能影响FMWHBE兔骨基质的矿化，使BMD降低。在本实验中，FMWHBE兔和WHBE兔拥有相似的血清Ca、P含量，但ALP水平显著低于WHBE兔，而WHBE兔除1月龄桡骨BMD显著低于JPW兔外，BMD与JPW兔相近，因此低ALP水平导致骨基质矿化较低可能是影响WHBE兔发生BMD降低和前肢畸形的主要因素。

根据骨质疏松的诊断标准，FMWHBE兔的肱骨、桡骨、尺骨均存在一定程度的骨质疏松，且病理学观察结果显示，FMWHBE兔肱骨、桡骨、尺骨与WHBE兔和JPW兔相比，骨皮质变薄，成骨细胞和新生骨组织较少。综上所述，FMWHBE兔可能适合作为骨生物力学研究的模型动物。

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Determination of Serum Calcium， Phosphorus and Alkaline Phosphatase Levels and Forelimb Bone Mineral Density in Forelimb Malformed White Hair and Black Eyes Rabbits

CHEN Fang-ming， XU Jian-qin， ZHU Ke-yan， YANG Qin-qin， CHEN Min-li
（The Research Center of Animal Experiment， Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310053， China）

Objective To observe the physiological and pathological characteristics of forelimb and serum calcium （Ca） and phosphorus （P） levels in forelimb malformed white hair and black eyes （FMWHBE）rabbits， to discuss the possible causes of forelimb malformation in white hair& black eyes （WHBE）rabbits， and to evaluate possibility of FMWHBE rabbit as a potential model in bone biomechanics research such as spontaneous osteoporosis animal model. Method Totally 1， 2， 3 and 4 months old FMWHBE rabbits， WHBE rabbits and Japan white （JPW） rabbits were used respectively （6 rabbits in each group，totally 72 rabbits）.The levels of serum Ca， P and alkaline phosphatase （ALP） were tested in all rabbits. The bone mineral density （BMD） of fore humerus， radius and ulna were measured by using X-ray imaging system. Pathologic analysis was performed by H&E staining. Results Compared with JWP rabbits， the serum Ca content of 1， 2 and 4 months old FMWHBE rabbits was significantly lower （P＜0. 05 or P＜0.01）. The serum P content of 4 months old FMWHBE rabbits was significantly higher than JPW rabbits at the same age（P＜0.05 or P＜0.01）. The serum ALP levels of FMWHBE rabbits was significantly lower than JPW rabbits and WHBE rabbit （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with the same period WHBE rabbit， the BMD of fore humerus of 1-4 month old FMWHBE rabbit ， radial of 2， 3， 4-month-old rabbit and ulna of 2-month-old FMWHBE rabbit were significantly lower （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with the same period JPW rabbits ， the BMD of fore humeral and radius of 1， 3 months old rabbits， the ulna of 1， 2-month old rabbits were significantly lower （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with WHBE and JPW rabbits， the cortex of fore humerus， radius and ulna in FMWHBE rabbits was thinner. There were less osteoblasts on local bone tissue surface and none of them were arranged in a layer trimly. Bone canalicules and new bone tissue were less. Conclusion The malformation of FMWHBE rabbits may be related with the low levels of Ca and P in blood leading the loss of osteoblasts and new bone tissue.

Forelimb malformed white hair& black eyes （FMWHBE） rabbits； Bone mineral density （BMD）； Calcium（Ca）； Phosphorus（P）； Alkaline Phosphatase（ALP）

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0019-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.004

2015-02-11

浙江省科技厅公益性（动物平台）项目（2012C37079）

陈方明（1981-）， 男， 实验师， 研究方向: 实验动物与比较医学。E-mail: ucika@sina.com

陈民利（1963-）， 女， 教授， 研究方向: 实验动物与比较医学。E-mail: cmli991@aliyun.com