基于代谢组学技术研究泽泻对高脂血症大鼠防治的生物化学作用机制

苗　华

(西北大学 体育教研部, 陕西 西安　710069)



·生命科学·

基于代谢组学技术研究泽泻对高脂血症大鼠防治的生物化学作用机制

苗华

(西北大学 体育教研部, 陕西 西安710069)

利用代谢组学方法鉴定泽泻对高脂饲料诱导的高脂血症治疗的尿液生物标示物和阐明生物化学作用机制。超高压液相色谱和质谱联用测定对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组尿液,采用偏最小二乘判别分析法研究对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组之间的代谢物谱差异,鉴定了14个生物标示物,高脂血症模型组高脂饲料上调了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同时下调了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉碱和甲基肌苷。泽泻提取物逆转了这些异常上调和下调的生物标示物。泽泻提取物改善了由高脂饲料造成的异常的脂肪酸代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢。代谢组学技术能够应用于高脂血症及其泽泻对其治疗的生物化学作用研究。

高脂血症;代谢组学;泽泻;超高压液相色谱;质谱;脂肪酸代谢;氨基酸代谢;嘌呤代谢

随着生活节奏的加快和饮食结构的改变,高脂血症已成为影响人类健康的主要疾病之一。高脂血症是高甘油三酯血症和高胆固醇血症的统称。高脂血症是指由各种原因导致的血浆中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇过高和高密度脂蛋白胆固醇过低等脂代谢异常。高脂血症容易导致动脉粥样硬化(头部的脑动脉、心脏的冠状动脉、肾脏动脉等阻塞),是心脑血管疾病的病理学基础。随着中药对高脂血症治疗研究进步,中药在治疗高脂血症和防治心脑血管相关疾病方面显现出独特的优势,因其疗效显著、持续且副作用小而备受关注,具有广阔的应用前景。我们以前的研究显示大黄、茯苓和茯苓皮对高脂饲料诱导的高脂血症大鼠有较好的治疗作用[1-4],中药泽泻性寒,味甘、淡,归肾、膀胱经。具有利水渗湿、化浊降脂、泄热通淋等功效,可用于小便不利、热淋涩痛、水肿胀满等症,药理研究证明泽泻具有利尿、抑制动脉粥样硬化和抗肾结石的活性[5-7],同时还有保肝、抗炎、降低血压以及抗高血脂等作用[7]。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动前后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)代谢产物图谱及其动态变化研究生物体系的代谢网络的一种技术。代谢组学已被广泛应用于高脂血症诊断、药物疗效与药物作用机理等方面[8-10]。我们以前的初步研究显示泽泻对高脂血症大鼠有较好的防治作用[11],本文利用代谢组学技术进一步研究泽泻提取物防治高脂血症的生物化学作用机制。

1　实验对象与方法

1.1泽泻乙醇提取物

泽泻样品经过干燥、粉碎后,根据报道方法,采用95%乙醇制备泽泻乙醇提取物[11]。

1.2实验动物及分组

健康雄性SD大鼠24只,随机分成3组,对照组:正常食料喂养;高脂血症模型组:高脂饲料喂养;泽泻提取物治疗组:高脂饲料喂养同时灌胃泽泻乙醇提取物10g/(kg·d-1),根据以前我们报道的给药和治疗方案获得大鼠的尿液[11]。

1.3代谢组学方法

在完成在美国Waters AcquityTM液相色谱仪和XevoTMG2 QTof质谱仪测得尿液。超高压液相色谱和质谱条件参考我们报道的方法[11]。

1.4数据分析

对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿液样品经色谱分离、质谱采集后生成初始结果RAW文件,经Markerlynx XS 软件进行色谱峰自动识别和峰匹配,产生含保留时间、质荷比及响应强度信息的代谢产物列表;将该矩阵列表导入Markerlynx软件进行偏最小二乘法-判别分析和载荷图分析。所有数据用平均值±标准偏差表示,两组间差异比较,采用t检验,P<0.05表示统计学上存在显著性。

2　结果和讨论

2.1正常组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿样的代谢组学分析

在正离子模式下,采用UPLC-MS方法采集大鼠对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组尿样的数据。图1为正离子模式下典型的大鼠对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组尿样的BPI色谱图。其显示对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组存在一定的差别,MakerLyxn软件对所采集的对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组尿样的数据进行峰提取和峰匹配,共识别出3 160个离子信息。

2.2对照组、高脂血症模型组和泽泻提取物治疗组大鼠尿样的多元统计分析

为了更好地了解对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组内源性代谢产物的变化,在正离子模式下,我们采用PLS-DA分析方法对对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿样代谢谱数据进行多元统计分析。对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿液的PLS-DA分析结果显示对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组明显的分开,对照组与高脂血症模型组距离较远,通过泽泻治疗后的高脂血症模型组明显的接近对照组,证明泽泻对高脂血症有明显的治疗作用(图2A)。

图1　正常对照组(A)、高脂血症模型组(B)和泽泻提取物治疗组(C)尿液的BPI色谱图Fig.1　Urinary BPI chromatograms obtained from the control group (A) and hyperlipidemia group (B) and Alisma orientale treatment group (C)

图2　对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组尿液的PLS-DA投影图(A)和作为选择生物标示物的PLS-DA 载荷投影图(B)Fig.2　PLS-DA score plot based on the urinary metabolic profiling of the control group and hyperlipidemia group and Alisma orientale treatment group (A) and PLS-DA loading plot used in biomarkers selection (B)

2. 3生物标示物结构鉴定

鉴定内源性代谢产物是代谢组学研究的重要部分。基于UPLC-MS的代谢组学方法主要通过精确质量数、质谱碎片信息、同位素分布和标准品对照确定代谢产物的结构[12-14]。表1显示了对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿液中鉴定的14个生物标示物、变化趋势及其代谢途径。鉴定的代谢产物主要包括脂肪酸、氨基酸、3-甲基尿苷、吲哚-3-甲酸、肌酐、多巴胺、尿酸等,这些内源性代谢产物的异常变化表明了在高脂血症大鼠中高脂饲料干扰了脂肪酸代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢等,这些结果和我们以前的研究一致[15]。泽泻提取物对这些紊乱的代谢产物起到不同程度的逆转作用,改善了异常的脂肪酸、氨基酸和嘌呤代谢途径。

表1　对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组大鼠尿液中鉴定的14个生物标示物、变化趋势及其代谢途径

注:a对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组的鉴定的代谢产物升高(↑)或降低(↓),高脂血症模型组与对照组比较:*P<0.05;**P<0.01;泽泻提取物治疗组与高脂血症模型组比较:#P<0.05,##P<0.01

2.4生物标示物相关系数分析

为了研究泽泻提取物对高脂血症的防治效果,我们应用相关系数分析研究鉴定的生物标示物和对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组的关系。图3显示了鉴定的14个代谢产物在对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组的变化趋势。变化趋势朝上的是和对应组正相关,反之,朝下的是和对应组负相关。生物标示物3，7，12，13和14是和对照组正相关;生物标示物1，2，4，5，6，8，9和11是和对照组负相关,这些结果证明14个代谢产物正常的代谢变化趋势。生物标示物1，2，3，4，5，6，8和9是和高脂血症模型组正相关;生物标示物7，10，11，12，13和14是和高脂血症模型组负相关,这些结果证明高脂饲料造成了高脂血症,高脂血症和这14个生物标示物的异常代谢有关。在泽泻提取物治疗组生物标示物1，2，3，4，5，6，8，9，12和14是和泽泻提取物治疗组正相关;生物标示物7，10，11和13是和泽泻提取物治疗组负相关,高脂血症组大鼠的生物标示物经过泽泻提取物治疗恢复到了对照组的生物标示物的变化趋势,泽泻提取物治疗组生物标示物的整体变化趋势和对照组的变化趋势一致,表明泽泻提取物对高脂血症大鼠有较好的改善作用。

图3　对照组、高脂血症模型组及泽泻提取物治疗组的PLS-DA相关性系数分析Fig.3　Correlation coefficient analysis of PLS-DA from control and hyperlipidemia and Alisma orientale treatment groups

2.5生物标示物生物化学代谢途径分析

高脂血症模型组高脂饲料上调了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同时下调了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉碱和甲基肌苷。生物标示物硬脂酸酰胺、油酸酰胺、十六烷酰胺和二十四碳六烯酸的代谢异常表明高脂饲料导致大鼠脂肪酸代谢紊乱。生物标示物油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六烷酰胺是脂肪酰胺水解酶的底物,脂肪酰胺水解酶的生物活性影响水解酶的相对比率[16]。因此在泽泻提取物治疗组下调硬脂酸酰胺、油酸酰胺和十六烷酰胺可能造成上调的脂肪酰胺水解酶。二十四碳六烯酸是以亚麻酸为底物经过碳链延伸和去不饱和度化学反应的产物,二十四碳六烯酸再经过C24:6n-3到C22:6n-3的脂肪酸的β-氧化反应产生二十二碳六烯酸。降低的二十四碳六烯酸与异常的脂肪酸β-氧化有关,然而泽泻提取物改善了高脂血症中存在的脂肪酸β-氧化异常的发生。

生物标示物3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸的异常表明高脂血症大鼠氨基酸的代谢的紊乱。生物标示物3-氧-甲基多巴、甲基多巴和苯丙氨酸在动脉粥样硬化有重要作用[17]。高脂血症中下调的3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸和泽泻提取物治疗上调这些代谢产物证明泽泻对高脂血症有较好的治疗作用。

生物标示物尿酸和甲基肌苷的异常表明高脂血症大鼠尿液嘌呤代谢的紊乱。尿酸是嘌呤代谢的最终氧化产物,黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤到尿酸。生物标示物肌酐的异常表明高脂血症大鼠肌酸或能量代谢的紊乱。肌酐是肌肉在人体内代谢的产物,肌酐是检测肾功能的生物标示物,增加的肌酐标志肾脏的代谢异常[18-19]。因此，增加的肌酐可能意味着在高脂血症大鼠肾功能受到影响。

3　结　论

采用高脂饲料诱导的高脂血症大鼠研究泽泻对其治疗的生物标示物和生物化学作用机制,研究显示泽泻改善了高脂血症中紊乱的脂肪酸代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢。代谢组学技术能够应用于高脂血症及泽泻对其的治疗生物化学作用机制研究。

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(编辑陈镱文)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats

MIAO Hua

(Department of Physicsl Edneation, Northwest University, Xi′an 710069, China)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats was studied by metabolomic approach. Urinary from control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups was analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Acquired data were subjected to PLS-DA for differentiating the control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups. Biomarkers were identified by PLS-DA. Fourteen metabolites were identified as potential biomarkers. Compared with control rats, up-regulated octadecanamide, oleamide, 3-methyluridine, palmitic amide, indole-3-carboxylic acid and creatinine as well as down-regulated tetracosahexaenoic acid, 3-O-methyldopa, 3-indole carboxylic acid glucuronide, dopamine, uric acid, phenylalanine, L-carnitine and methylinosine were observed in diet-induced hyperlipidemia group. The up-regulation and down-regulation of metabolites were reversed by treatment withAlismaorientale. The perturbations of fatty acid metabolism, amino acid metabolism and purine metabolism were observed in diet-induced hyperlipidemia rats. The study shows that metabonomics could be applied to investigation of identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats.

hyperlipidemia; metabolomics;Alismaorientale; ultra-performance liquid chromatography; mass spectrometry; fatty acid metabolism; amino acid metabolism; purine metabolism

2015-12-04

国家自然科学基金资助项目(81202909，81274025， 81001622)；西北大学本科教学质量与教学改革工程基金资助项目(JX13037)

苗华，女，副教授，河南南阳人，从事中药药理学和代谢组学研究。

R285.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-017