HPLC法同时测定秦皮中四种成分含量的研究

李晓尧　张　丹　汤丽芝　史亚军　王昌利

陕西中医药大学药学院(咸 阳712046)



·方药纵横·

HPLC法同时测定秦皮中四种成分含量的研究

李晓尧张丹汤丽芝史亚军王昌利

陕西中医药大学药学院(咸 阳712046)

目的：建立同时测定秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的HPLC法，为秦皮的质量评价提供定量方法基础。方法：色谱柱：Betasil-C18(250mm×4.6mm，5μm,LOT：13697)，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(13∶87)，检测波长：334nm，柱温：30℃，流速：1ml/min。结果：秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷分别在0.3090～3.0900μg、0.1275～1.2750μg、0.0276～0.2760μg、0.0540～0.5400μg(r=0.999)呈线性关系。结论：本法简单、快速，重现性好，准确度高，色谱峰分离度好。

主题词色谱法，高压液相秦皮

ABSTRACT

Objective:To establish a simultaneous determination aesculin , aesculetin, fraxin, fraxetin of HPLC method, provide a quantitative method for quality evaluation of fraxini cortex . Methods: Chromatographic column: Betasil - C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm，the LOT: 13697), mobile phase: acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution (13∶87) , detection wavelength: 334 nm, column temperature:30℃, the flow rate: 1ml/min. Results: Aesculin, aesculetin , fraxin , fraxetin in 0.3090～3.0900μg, 0.1275～1.2750μg, 0.0276～0.2760μg, 0.0540～0.5400μg (r=0.999) have a good linear relationship. Conclusion: This method is simple, rapid, good reproducibility, high accuracy, good chromatographic peak separation.

秦皮来源为木犀科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树或宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮。主产于陕西、河北、河南、山西、辽宁、吉林等地[1]。始载于《神农本草经》,列为中品,其主要功效有清热燥湿、平喘止咳、收涩止痢、抗菌、明目,常用于治疗泄泻、眼部疾病、感染性疾病、原发性高尿酸血症等。秦皮的化学成分包括香豆素类、酚类、皂苷、鞣质、生物碱等，其中香豆素类成分为秦皮的主要有效成分[2]。近年有关秦皮的药理学实验发现秦皮具有抗炎、镇痛及止咳祛痰的作用[3-4]。有关秦皮中香豆素类成分的含量测定，早期有文献报道以紫外分光光度法及薄层扫描法定量分析秦皮甲素与秦皮乙素的含量，《中国药典》及近年来多采用高效液相色谱法测定秦皮甲素、秦皮乙素的含量，对秦皮甲素、秦皮乙素的总含量做出了规定[5]。本文实验进一步采用HPLC法同时测定秦皮饮片中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷四种香豆素类单体成分的含量，为后期建立秦皮饮片质量评价体系提供含量测定方法学依据。

1仪器与试药1 .1仪器U3000型反相高效液相色谱仪(德国戴安)；AR1140型电子天平(万分之一，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KH-400-KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；QE-300g粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)。

1.2试药秦皮甲素、秦皮乙素及对照品，(购于中国食品药品检定研究院，批号: 秦皮甲素 110740-200104、秦皮乙素110741-200607，秦皮素111731-200501、秦皮苷对照品由西玛实验室提供)；甲醇、磷酸均为分析纯(成都市科龙化工有限公司)；乙腈为色谱纯(赛默飞世尔中国有限公司)；水为纯净水。秦皮饮片分别来源于兴盛德饮片厂及西安市万寿路药材市场，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为尖叶白蜡树。

2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Betasil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(13∶87)，检测波长：334nm，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量为10μl。

2.2对照品溶液的配制精密称取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品、秦皮素对照品、秦皮苷对照品适量，加甲醇溶解并配制成每1ml含秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品、秦皮素对照品、秦皮苷对照品分别为0.1545mg、0.0255mg、0.0138mg、0.0270mg的对照品混合溶液。

2.3供试品溶液配制[1]取约0.5g的样品粉末(使通过三号筛)，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，再精密加入50ml甲醇，密塞，称定总重量，加热回流1h，放冷，拆下，再称定总重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.4方法学考察2.4.1专属性：秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷对照品溶液色谱图及样品中4种成分的色谱图见图1，结果显示，各组分分离度好，无干扰。

1.秦皮甲素　 2.秦皮苷 3.秦皮乙素　4.秦皮素

2.4.2线性关系的考察：分别精密吸取“2.2”项下对照品混合溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、15μl、20μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y),建立标准曲线，计算回归方程。结果见表1。

表1　 回归方程与线性范围(n=3)

2.4.3精密度：取“2.2”项下对照品混合溶液，精密吸取10μl，连续进样5次，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算各成分峰面积的RSD值。得秦皮甲素RSD=1.04%；秦皮乙素RSD=0.29%；秦皮素RSD=0.57%；秦皮苷RSD=0.52%，结果表示本法具有良好的精密性。

2.4.4重复性：取样品1按“2.3”项下方法，配制5份平行的供试品溶液，精密吸取10μl，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定峰面积，计算RSD值。得秦皮甲素RSD=0.56%；秦皮乙素RSD=1.82%；秦皮素RSD=1.32%；秦皮苷RSD=1.08%，各成分RSD均小于2%，表明了本法的重复性良好。

2.4.5稳定性：取样品1的供试品溶液，分别在室温放置0h、2h、4h、6h、8h、12h，精密吸取10μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，计算RSD值。得秦皮甲素RSD=0.62%；秦皮乙素RSD=1.68%；秦皮素RSD=1.94%；秦皮苷RSD=1.99%，各成分RSD均小于2%，说明样品在12h内稳定。

2.4.6加样回收率：取同一批样品粉末(过三号筛)约0.25g(样品中含秦皮甲素1.04%,秦皮乙素0.27%，秦皮素0.09%，秦皮苷0.67%)，精密称定6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.60mg/ml秦皮甲素、0.68mg/ml秦皮乙素、0.23mg/ml秦皮素和1.68mg/ml秦皮苷对照品溶液各1ml(挥干溶剂)，再精密加入50ml甲醇，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，根据峰面积，计算各成分的平均加样回收率及RSD。结果见表2。

表2　4种成分的加样回收率(n=6)

2.5样品的测定取10批样品，按“2.3”项下方法制备各样品供试液，依“2.1”行下色谱条件进样测定，结果见表3。根据2015版《中国药典》的规定，编号为4、5的样品含量不符合规定，其余8批测定结果显示，秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的总含量不低于1.1%。

表3　样品的含量测定结果

3讨论关于供试品的制备，2015版《中国药典》中采用加热回流提取，有文献采用超声提取法，实验中对比了加热回流提取的与超声提取供试品溶液的含量测定，表明加热回流提取制备的供试品溶液的含量测定明显高于超声提取，故本法最终确定以加热回流制备供试品溶液。测定波长的选择，根据有关文献及药典规定，对比了254nm及334nm波长下的色谱峰，结果显示：以334nm为检测波长的色谱峰峰形明显比254nm检测波长下的峰形好。对比其他相关的秦皮含量测定研究，本文采用的HPLC法的优点在于流动相配比简单，在等度条件下即可同时测定出四种成分的含量，方法简单可控，重复性好，且色谱峰峰形良好，分离度高。2015版《中国药典》中用HPLC法测定了秦皮甲素及秦皮乙素的含量，且规定两种成分在秦皮饮片中总量不得少于0.8%,但在实际实验中，10批样品的测定结果表明，有编号为4、5号的两批样品不符合药典规定，其余8批中测定结果显示秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素的总含量最低为1.1%。且发现秦皮甲素、秦皮苷两种苷类香豆素成分的含量均高于秦皮乙素、秦皮素两种苷元含量的3倍。

秦皮中秦皮甲素、秦皮苷为苷类香豆素成分，而秦皮乙素、秦皮素是秦皮甲素、秦皮苷的苷元成分，因此新鲜秦皮中秦皮甲素、秦皮苷含量明显多于秦皮乙素、秦皮素，若保存不当或炮制工艺不当，秦皮甲素、秦皮苷易被水解为秦皮乙素、秦皮素，而使测定的含量有所改变，本文采用HPLC法同时测定秦皮中甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的含量，可以更准确的评价秦皮质量，为建立秦皮饮片质量评价体系奠定基础。

[1]国家药典委员会.中国药典,一部 [S].北京:化学工业出版社,2015:271.

[2]刘国宇,周军辉,崔新爱,等.秦皮的化学成分研究进展[J].西北药学杂志，2016,31(2):220-222.

[3]任茜,陈国联,李万波.秦岭白蜡树属药用植物体外抗菌作用实验研究[J].陕西中医,2012,33(6):756-757.

[4]杨春雪,汪业菊,谢明杰.秦皮素抑菌活性及其机制研究[J].免疫学研究,2012,28(8);703-705.

[5]叶迎,柏冬,包强，等.秦皮提取物中香豆素类成分含量测定方法研究[J].2015,8(22),83-85.

(收稿2016-02-25；修回2016-05-12)

HPLC method for simultaneous determination of four component content in fraxini cortex

Shaanxi University of Tranditional Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Li Xiaoyao Zhang Dan Tang Lizhi et al

Chromatography, high pressure liquidFraxini cortex

R681.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.063