APP下载

四逆散对慢性胰腺炎模型小鼠MDA和SOD表达水平的影响*

2016-09-28史迎莉许小凡张晓芹

陕西中医 2016年9期
关键词:灌胃造模胰腺

史迎莉 许小凡 刘 芳 张晓芹 张 红

陕西中医药大学医学科研实验中心(咸阳712046)



四逆散对慢性胰腺炎模型小鼠MDA和SOD表达水平的影响*

史迎莉许小凡刘芳张晓芹张红△

陕西中医药大学医学科研实验中心(咸阳712046)

目的:观察四逆散对慢性胰腺炎小鼠胰腺组织中MDA和SOD的影响。方法:48只昆明小鼠,随机分为3组。模型组与四逆散组经尾静脉一次性注射二氯二丁基酯(DBTC) 0.8mg/100g体重,并用10%的乙醇代替饮用水,诱发小鼠慢性胰腺炎。造模后72h,治疗组给予四逆散6g/(kg·d)灌胃,空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃。分别于造模后2周、8周,处死小鼠,取胰腺组织,检测MDA和SOD的变化,HE染色观察胰腺病理学改变。结果:造模后,模型组胰腺MDA的水平持续升高,而SOD活性持续降低,二者于相应时间点的对照组相比差异显著。HE染色结果显示,造模后2周,模型组小鼠胰腺可见炎细胞浸润,胰腺小叶间纤维化;造模后8周,可见腺泡细胞和胰岛明显减少,大量炎细胞浸润,胰腺实质坏死,被纤维组织替代;四逆散治疗后,与模型组相比,相应时间点胰腺组织MDA的水平下降,而SOD的水平有所升高;相应时间点胰腺组织的损伤有所减轻。结论:四逆散通过调节胰腺组织MDA和SOD的活性水平来防治DBTC联合乙醇所致慢性胰腺炎小鼠的胰腺炎纤维化。

主题词胰腺炎四逆散

慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是由多种原因引起的胰腺实质出现不可逆的慢性炎症,胰腺间质纤维化,胰腺腺泡和胰岛萎缩或消失,引起胰腺内、外分泌功能不全,临床表现为反复发作的上腹痛[1]。近年来,CP在我国发病率不断增高,临床上无特异性的疗法,仅限于对症治疗或缓解症状,治疗效果不佳,临床难以治愈[2]。本实验采用小鼠尾静脉注射二氯二丁基酯(Dibutyltin Dichloride,DBTC),同时饮用10%乙醇诱发小鼠CP模型,给予四逆散灌胃,观察其对CP小鼠胰腺丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平的影响,探讨四逆散防治CP的作用机制。

1材料1.1试剂与仪器四逆散(柴胡6g,枳壳、白芍、黄芩、木香各5g,炙甘草3g)中药饮片购自陕西中医药大学一附院中药房,常规水煎浓缩至29ml(1g生药/ml),分装后置于4℃冰箱保存备用。二氯二丁基酯(DBTC)购自Sigma-Aldrich;小鼠SOD和MDA检测试剂盒购于南京建成生物所;组织匀浆机(德国IKA);酶标仪(Bio-Tek,ELX808);高速冷冻离心机(德国eppendorf,5430R),显微镜及图像采集系统(德国蔡司Axio Imager,A2)。

1.2动 物昆明小鼠48只,雄性,6~8周龄,体重20~28g;购于第四军医大学实验动物中心(动物合格证号:0001249)。

2方法2.1分组及造模将48只小鼠随机分为3组(n=16),即对照组(尾静脉注射0.9% NaCl+正常饮水);模型组(尾静脉注射DBTC+饮用10%乙醇);四逆散组(尾静脉注射DBTC +饮用10%乙醇+四逆散灌胃)。模型复制:48只昆明小鼠,保持室温20℃~25℃,自由饮水、摄食,适应性喂养1周,适应环境后用于实验。将80mg DBTC溶于30ml无水乙醇,缓缓加入10ml甘油,再滴加生理盐水至50ml,摇至清亮(1.6g/l),经尾静脉一次性注射DBTC(0.8mg/100g)后,用10%乙醇代替饮用水,常规饲料饲喂,复制小鼠CP模型。造模后第3天,随机分为模型组和四逆散组,模型组饮用10%乙醇,标准饲料饲喂;四逆散组给予四逆散浓缩液生药含量6g/(kg·d),0.2~0.4ml/只/d灌胃,1剂/d,分别灌胃2周、8周,同时饮用10%乙醇。对照组按照50μl/10g体重经尾静脉注射生理盐水,之后常规摄食、饮水。对照组和模型组在相同的时间点给予等量生理盐水灌胃。

2.2标本采集与检测分别于造模后2周、8周乙醚吸入麻醉,处死实验动物,完整摘取胰腺,一部分胰腺用10%甲醛浸泡固定,行HE染色并观察病理学改变;另一部分新鲜胰腺,液氮速冻后,-80℃冰箱保存,制备组织匀浆,进行SOD和MDA活性检测。

2.3胰腺组织的病理学改变甲醛固定后的胰腺组织,常规石蜡包埋、切片,进行苏木素-伊红染色,镜下观察各组胰腺的形态学改变,并拍照采集图像。

2.4胰腺MDA和SOD的检测取50mg新鲜胰腺组织置于EP管中,加入缓冲液,用组织匀浆器匀浆,高速冷冻离心机4℃,10000r/min,离心10min,吸取上清,按试剂盒要求检测胰腺组织MDA和SOD表达水平。

2.5统计学方法用均数±标准差表示实验数据,用SPSS13.0统计软件处理分析,各组间的比较采用单因素方差分析,P<0.05表示具有统计学意义。

3结果3.1胰腺组织的病理学变化如图1所示,造模后2周,模型组小鼠胰腺可见少量胰腺腺泡细胞萎缩、坏死,炎细胞浸润,小叶间可见少量纤维化;造模后8周,可见胰腺腺泡细胞及胰岛萎缩、消失,大量纤维组织增生。但是四逆散治疗组,在相同时间点胰腺的炎症损伤程度及纤维化程度明显减轻。

A:对照组2周;B:对照组8周;C:模型组2周;D:模型组8周;E:四逆散组2周;F:四逆散组8周

3.2胰腺组织MDA和SOD活性变化小鼠尾静脉注射DBTC造模后,胰腺组织MDA水平随着造模时间的延长,持续升高;而SOD水平则随着造模时间延长持续降低,与对照组相比,差异具有显著性(P<0.01);四逆散组MDA水平与相同时间点模型组相比明显降低,而SOD水平与相同时间点模型组相比明显升高,差异具有显著性 (P<0.01)。

4讨论CP病因复杂,如长期饮酒或胆道疾病等可引起胰腺实质慢性炎症,最终被纤维结蹄组织代替[1]。SOD是生物体内广泛存在的一种金属酶,能将超氧阴离子催化为过氧化氢和氧气,清除体内氧化自由基,使体内自由基的产生与清除保持动态平衡,起到重要的抗氧化作用[3]。MDA是氧自由基作用于机体脂质发生过氧化的产物,其含量高低可间接反映机体内氧自由基的含量及机体受损伤程度[4]。SOD能够清除过量的氧自由基、消除炎症,具有极强的抗炎作用[5]。慢性胰腺炎就是一种不可逆的炎症性疾病,体内堆积过多的氧自由基,如不能及时被清除,将与细胞膜发生反应,生成过多的MDA引起炎症反应和组织损伤[6]。SOD能够抑制炎症的进展、具有抗氧化的作用,从而减轻胰腺纤维化程度,因此检测SOD含量对慢性胰腺炎的诊断和治疗有客观价值。

近期实验研究发现,在注射 DBTC 基础上联合饮用10% 乙醇的造模方法复制小鼠CP模型,这种方法成功率高、成本较低,造成的小鼠CP模型较符合人慢性胰腺炎的病理特征和血清学改变,适合做药物治疗研究[7]。本实验发现,CP发展过程中机体的抗氧化能力不断降低。四逆散灌胃治疗后,可通过抗氧化作用,减轻CP小鼠的胰腺损伤程度。

CP属于中医的“腹痛”范畴,多为脾虚、肝郁气滞,血瘀所致。四逆散出自《伤寒论》,是疏肝透解,活血化瘀,缓急止痛的要方。本实验在原方:柴胡、白芍、枳壳、甘草的基础上加入黄芩、木香。近期药理研究显示,柴胡皂甙具有很强的抗炎作用及抗纤维化作用;黄芩苷具有抗氧化及清除氧自由基的能力;芍药苷具有抗自由基损伤的作用,能减少SAP大鼠胰腺促炎因子的释放,对大鼠SAP具有治疗作用[8]。枳壳、甘草酸亦具有抗炎、抗氧化作用,木香具有行气利胆,镇痛的作用。我们的实验结果亦发现,四逆散治疗组小鼠,胰腺组织的MDA在2周,明显下降,并一直维持在较低水平,而SOD的水平在治疗后逐渐升高。提示四逆散能够通过提升CP小鼠胰腺的抗氧化能力,减轻CP小鼠的胰腺损伤程度及胰腺纤维化的程度,为四逆散用于临床防治CP提供了实验根据。

[1]中华医学会外科学分会胰腺外科学组. 慢性胰腺炎诊治指南(2014)[J]. 中国实用外科杂志,2015,35(3):277-282.

[2]张天玲,苏式兵.中药防治慢性胰腺炎的基础实验研究进展[J].中华中医药学刊,2011,29(6):1225-1228.

[3]张笑天,郑晓瑛.氧化自由基清除剂超氧化物歧化酶与疾病[J].中国公共卫生,2014,30(10):1349-1352.

[4]王少言,初巍巍,霍阳,等. 黄芪注射液对重症急性胰腺炎大鼠外周血清氧化相关物质的影响[J].解放军医药杂志,2014,26(12):5-7.

[5]朱秀敏.超氧化物歧化酶的生理活性[J].当代医学,2011,17(15):26-27.

[6]赵铁华,唐晓勇,盛丽,等.胆胰宁对慢性胰腺炎大鼠血清及胰腺组织中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(20):230-233.

[7]张晓芹,许小凡,姜婷婷,等.柴胡疏肝散通过抗氧化反应对二氯二丁基酯联合乙醇诱发小鼠胰腺纤维化的防治作用[J].中国病理生理杂志,2014,30(10):1827-1832.

[8]李仁国.柴胡有效成分及药理作用分析[J].陕西中医,2013,34(6):750-751.

(收稿2016-03-30;修回2016-05-15)

*陕西省咸阳市科技局自然科学基金[2011K13-06(1)]

R657.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.072

猜你喜欢

灌胃造模胰腺
同时多层扩散成像对胰腺病变的诊断效能
肾阳虚证动物模型建立方法及评定标准研究进展
脾肾阳虚型骨质疏松症动物模型造模方法及模型评价
胆囊胆固醇结石湿热证小鼠造模方法的研制与评价
湿热证动物模型造模方法及评价研究
小鼠、大鼠灌胃注意事项
来曲唑灌胃后EM大鼠病灶体积及COX-2 mRNA、survivin蛋白表达变化
哪些胰腺“病变”不需要外科治疗
18例异位胰腺的诊断与治疗分析
实验小鼠的灌胃给药技巧