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中国临床球形孢子丝菌菌丝相药物敏感性分析

2016-09-28贺羽黄宜进赵秘密周汛

中国真菌学杂志 2016年4期
关键词:碘化钾伊曲康唑两性霉素

贺羽 黄宜进 赵秘密 周汛,3

(1.重庆医科大学附属第一医院皮肤科,重庆 400016;2.四川省南部县人民医院,南充 637300;3.重庆市中医院皮肤美容科,重庆 400021)



·论著·

中国临床球形孢子丝菌菌丝相药物敏感性分析

贺羽1黄宜进2赵秘密1周汛1,3

(1.重庆医科大学附属第一医院皮肤科,重庆 400016;2.四川省南部县人民医院,南充 637300;3.重庆市中医院皮肤美容科,重庆 400021)

目的检测我国临床球形孢子丝菌菌丝相对5种抗真菌药物的体外敏感性,同时对比我国不同地区菌株药物敏感性的差异。方法将重庆、吉林、北京地区既往基因鉴定为球形孢子丝菌的100株临床菌株接种于2%马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,25℃恒温培养7 d获得菌丝相。依据美国临床与实验室标准化委员会(CLSI)制定的M38-A2方案,采用微量液基稀释法检测菌丝相对碘化钾、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、两性霉素B的体外最低抑菌浓度(MIC)。质控菌株为近平滑念菌ATCC22019。结果碘化钾体外无抗真菌活性,特比萘芬MIC几何均值为0.14 μg/mL,伊曲康唑和两性霉素B MIC几何均值分别为0.79 μg/mL和0.63 μg/mL,氟康唑MIC几何均值为45.89 μg/mL。发现7株对伊曲康唑耐药菌株,吉林地区相对较多,但不同地区菌株的药物MIC值差异无统计学意义(P>0.05)。结论碘化钾无体外抗真菌活性,我国临床球形孢子丝菌对特比萘芬最敏感,其次为伊曲康唑和两性霉素B,对氟康唑敏感性最差,不同地区菌株对抗真菌药物的敏感性没有明显差异。

球形孢子丝菌;菌丝相;药敏实验;微量液基稀释法

[Chin J Mycol,2016,11(4):209-212]

孢子丝菌病是孢子丝菌复合体感染人或动物引起的深部真菌病,该复合体包括6个菌种,不同菌种在地理分布、毒力、抗真菌药物敏感性上存在差异[1-2],我国致病菌种以球形孢子丝菌为主[3-4]。碘化钾是传统有效的首选药物,研究表明其在体外并没有抗真菌活性,其作用机制可能是通过机体内的髓过氧化物酶系统转化成碘,而起到抑制真菌细胞形成和破坏其超微结构的灭菌作用[5]。目前美国感染病协会(Infectious Diseases Society of America,IDSA)推荐伊曲康唑为固定型和淋巴管型孢子丝菌病的首选药物[5],然而耐药的报道逐年增多[6-7],并且因禁忌症、副作用等不能使用时,碘化钾、特比萘芬或氟康唑为推荐的次选药物。两性霉素B是治疗播散型孢子丝菌病的首选药物[8]。为了解碘化钾(Potassium iodide,KI)、特比萘芬(Terbinafin,TRB)、伊曲康唑(Itraconazole,ITC)、氟康唑(Fluconazole,FLC)、两性霉素B(Amphotericin B,AmB)对我国临床球形孢子丝菌的体外抗菌活性,同时对比我国不同地区菌株药物敏感性的差异,从而为临床用药提供依据,本研究对既往经基因鉴定为球形孢子丝菌的100株临床菌株进行药物敏感性测定。

1 材料和方法

1.1实验菌株

100株孢子丝菌分离自孢子丝菌病患者皮损处。37株来自重庆医科大学附属第一医院,编号C01-C37;47株来自吉林大学第二医院,编号J1-J47;16株来自北京大学附属医院,编号B01-B16。所有菌株既往经基因鉴定为球形孢子丝菌。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019。

1.2抗真菌药物

KI(Sigma公司)、TRB(中国鸿兵有限公司)、ITC(Adamas公司)、FLC(中国鸿兵有限公司)、AmB(重庆鼎国生物技术有限公司)。FLC、KI用无菌蒸馏水分别溶解为1 280 μg/mL、5 000 μg/mL,其余药物用二甲基亚枫(DMSO)溶解为1 600 μg/mL,d=0.22 μm无菌滤器滤过除菌后-70℃储存。使用前用RPMI1640培养基稀释至两倍工作浓度。KI工作浓度为0.98~500 μg/mL,FLC为0.125~64 μg/mL,其余药物为0.031 3~16 μg/mL。

1.3菌悬液制备

菌株接种于2%马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,25℃培养7 d获得菌丝相。试管中加入8.5 g/L无菌生理盐水3 mL,无菌移液管轻轻刮取菌落表面,反复吹打后静置15 min,取上层均质溶液至无菌EP管中,漩涡振荡器混匀,酶标仪在530 nm下调整A值为0.09~0.11,再用RPMI1640培养基稀释50倍获得两倍终浓度菌悬液(终浓度0.4×104~5×104CFU/mL)[9-10],同时采用血球计数板计数。

1.4真菌药敏实验

96孔板每行第1~10孔分别依次加入不同浓度的同种药液100 μL和菌悬液100 μL,第11孔加入100 μL菌悬液和100 μL RPMI1640培养基作为阳性对照,第12孔加入200 μL RPMI1640培养基作为阴性对照。28℃静置培养46~50 h后,酶标仪530 nm下测定吸光光度值,与阳性对照孔相比下降100%对应的药物浓度为ITC、AmB、KI的MIC值,下降80%为TRB的MIC值,下降50%为FLC的MIC值[9]。质控菌株ATCC22019的药物MIC值在质控范围内认为实验方法可靠。

1.5统计学处理

记录MIC值,计算几何均数(GM)、MIC50、MIC90,使用SPSS 17.0软件对MIC值进行非参数秩和检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结  果

KI对所有菌株无体外抗菌活性,梯度浓度范围内所有测试孔及阳性对照孔均有菌生长。TRB的MIC范围为0.03~0.5 μg/mL,MIC50为0.13 μg/mL,MIC90为0.5 μg/mL,GM为0.14 μg/mL;ITC的MIC范围为0.13~16 μg/mL,MIC50为1.0 μg/mL,MIC90为2.0 μg/mL,GM为0.79 μg/mL;AmB的MIC范围为0.13~4 μg/mL,MIC50为1.0 μg/mL,MIC90为2.0 μg/mL,GM为0.63 μg/mL;FLC的MIC范围为4~>64 μg/mL,MIC50为64 μg/mL,MIC90为64 μg/mL,GM为45.89 μg/mL(见表1)。不同药物MIC值进行比较差异有统计学意义(P=0.000<0.05),多重比较显示ITC与AmB差异无统计学意义(P=0.069>0.05),其余药物两两比较显示差异有统计学意义(P=0.000<0.05),可见TRB最敏感,其次为ITC和AmB,FLC敏感性最差。

对重庆(n=37)、吉林(n=47)、北京(n=16)地区菌株的MIC值进行比较发现,TRB、ITC、AmB、FLC对不同地区球形孢子丝菌的MIC值差异均无统计学意义(P值分别为0.485、0.118、0.863、0.953,均>0.05)。

3 讨  论

孢子丝菌是双相型真菌,酵母相和菌丝相的药物MIC值存在差异,研究发现菌丝相普遍高于酵母相[11-12],导致这种差异的机制并不明确,哪种时相的药敏结果能更准确反应临床疗效仍需要深入研究[12]。双相型孢子丝菌的药敏实验方法包括微量稀释法、E-test法、纸片扩散法等。纸片扩散法主要推荐用于酵母相的药物敏感性检测。报道称E-test法与微量稀释法一致性较好,准确性高[13],但价格偏贵,而酵母相体外培养不易获得,因此本实验依据CLSI的M38-A2方案,采用微量液基稀释法检测我国临床球形孢子丝菌菌丝相对5种抗真菌药物的敏感性。

表1球形孢子丝菌菌丝相微量液基稀释法MIC测定结果(n=100)

Tab.1Susceptibility testing results of mycelium phase of 100 Sporothrix globosa isolates according to microdilution broth method(n=100)

地区MIC(μg/mL)TRBITCAmBFLC重庆Range0.03~0.50.13~80.13~48~>64(n=37)MIC500.130.50.564MIC900.252164GM0.120.640.5847.42吉林Range0.03~0.50.25~160.25~44~>64(n=47)MIC500.1310.564MIC900.52264GM0.150.880.6744.92北京Range0.03~0.50.25~40.13~28~>64(n=16)MIC500.1310.564MIC900.52264GM0.140.960.6245.25总计Range0.03~0.50.13~160.13~44~>64(n=100)MIC500.131164MIC900.52264GM0.140.790.6345.89

研究发现特比萘芬在体外具有最低MIC值(GM=0.14,见表1),抗菌活性最强,前期报道也表明其体外抗菌活性高于伊曲康唑和两性霉素B[6,14],本研究结果显示特比萘芬可推荐为孢子丝菌病的一线药物,而该药主要用于固定型和淋巴管型的治疗[15],对于播散型的治疗效果欠佳[16],因此临床用药需考虑体外药敏与体内疗效的符合率问题。伊曲康唑和两性霉素B分别是IDSA推荐用于固定型和播散型孢子丝菌病的首选治疗药物,本实验中显示了较好的MIC值。目前孢子丝菌的药敏MIC终点判读标准没有确立,M38-A2方案认为伊曲康唑MIC≥4.0 μg/mL应考虑为耐药[6],本实验中发现7%(7/100)菌株包括吉林4株、重庆2株、北京1株对伊曲康唑耐药,与Ottonelli Stopiglia试验中报道的5.9%耐药率相近[6],吉林耐药株相对较多,可能与该地区孢子丝菌最流行[17],菌株发生变异有关,总体来说伊曲康唑的抗菌活性地区间未见明显差异。根据Silveira等提出的两性霉素B药敏判读标准[18],本实验中该药对10%(MIC>1 μg/mL)的菌株显示出较低的抗菌活性,明显低于其报道的79%,可见我国球形孢子丝菌对两性霉素B较为敏感。氟康唑MIC值总体较高,显示出较低的体外抗菌活性,与其他学者研究结果一致[16,19],而氟康唑是治疗孢子丝菌病的二线药物,具有很好的临床疗效[20-21],这种体外药敏和体内疗效的差异可能与药物体内代谢等多种因素有关。碘化钾是治疗固定型孢子丝菌病的传统有效药物,而孢子丝菌与10%饱和碘化钾体外培养可存活表明其并没有体外抗菌活性[22-23],其作用机制尚不明确,Coskun等认为真菌暴露于机体防御系统时,碘化钾通过免疫或非免疫机制来抑制真菌肉芽肿的形成,但此过程机体中性粒细胞和单核细胞数量并没有增加。也有研究认为碘化钾是通过机体内的髓过氧化物酶系统转化成碘,而起到抑制真菌细胞形成和破坏其超微结构的灭菌作用,故没有体外抗菌活性[5,23]。本实验发现所有球形孢子丝菌对碘化钾均不敏感,再次证实了上述观点。

综上可见我国临床球形孢子丝菌与孢子丝菌复合体各隐含种的药物敏感性基本一致[6]。此外通过对比我国吉林、北京、重庆地区临床菌株对抗真菌药物的敏感性,发现吉林地区耐药菌株分布相对较多,但总体来说对5种试验药物的敏感性没有明显地区差异,这可能由基因型决定。虽然体外药敏结果和临床疗效受多方面因素的影响,前者不能完全指导临床用药,但仍有重要的参考意义。

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[本文编辑]施慧

In vitro antifungal susceptibilities of mycelium phase of Sporothrix globosa in China

HE Yu1,HUANG Yi-jin2,ZHAO Mi-mi1,ZHOU Xun1,3

(1.Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.People's Hospital of Nanbu Prefecture of Sichuan,Nanchong 637300,China;3.Department of Dermatology and Cosmetology,Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing 400021,China)

ObjectiveTo investigate the activities of five antifungal agents on mycelia form of Sporothrix globosa and compare the differences in antifungal susceptibilities in different areas of China.MethodsTotal 100 isolates which were identified as Sporothrix globosa by molecular identification from Chongqing,Beijing and Jilin were subcultured on 2% potato-dextrose agar plates at 25℃ for 7 d.Then according to modified CLSI microdilution method M38-A2,MICS were measured to evaluate the antifungal activities of potassium iodide(KI),itraconazole(ITC),terbinafin(TRB),fluconazole(FLC),amphotericin B(AmB) to these isolates in vitro.Candida parapsilosis ATCC22019 was used as quality control.ResultsPotassium iodide showed no antifungal activity against any Sporothrix globosa isolates.TRB gave the lowest geometric mean(GM=0.14 μg/mL) MIC.ITC and AmB showed almost the same activity against all strains tested and the GM was 0.79 μg/mL and 0.63 μg/mL respectively.FLC gave the highest GM MIC(45.89 μg/mL).Seven isolates(four from Jilin,two from Chongqing,one from beijing) were found to be itraconazole-resistant,There was no difference in susceptibility according to the geographical source of the isolates(P>0.05).ConclusionPotassium iodide showed no antifungal activities in vitro.TRB was the most active drug,followed by the ITC and AmB.FLC was the least effective drug.There was no difference in antifungal susceptibilities in different areas of China.

Sporothrix globosa;mycelium phase;antifungal susceptibility test;micro-broth dilution method

国家自然科学基金(31270062)

贺羽,女(汉族),硕士研究生在读.E-mail:15123825300@163.com

周汛,E-mail:zhouxun123@sina.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0209-04

2015-09-29

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