1株H5N6亚型禽流感病毒分子特征分析

余慧燕　邓斐　王慎骄　霍翔　戴启刚　祁贤

210009 南京，江苏省疾病预防控制中心急性传染病防治所



·论著·

1株H5N6亚型禽流感病毒分子特征分析

余慧燕邓斐王慎骄霍翔戴启刚祁贤

210009 南京，江苏省疾病预防控制中心急性传染病防治所

目的对从某活禽市场环境中分离出的1株H5N6亚型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/C13/2013，en/c13)进行全基因组序列测定，以揭示其基因起源和分子遗传特征。 方法 采用二代测序技术对该分离株进行全基因组测序，MEGA6.0软件进行序列比对和构建系统发生树。 结果 分离株NA基因与近年来中国禽类中流行的H6N6亚型禽流感的NA基因处于同一进化分支，其他7个基因(PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)都与近年来东亚地区流行的H5N1亚型禽流感的相应基因处于同一进化分支，分离株en/c13的HA蛋白裂解位点为PLREKRRKR↓GLF，是高致病性禽流感病毒的典型分子特征序列。HA蛋白上关键受体结合位点226和228位(按照H3亚型的HA蛋白序列排序)氨基酸分别是Gln和Gly，是典型的禽流感病毒受体结合特征。 结论 本研究从环境中分离到一株新的基因重配禽流感病毒，其中NA基因来源于H6N6禽流感病毒，而其他7个基因则来源于H5N1禽流感病毒。结果提示我国禽流感病毒基因重配频繁，进化活跃，需要加强对禽流感病毒的持续监测。

【主题词】禽流感病毒；H5N6亚型；基因重配

Fund programs: Key Provincial Talents Program of Jiangsu Province, China(RC2011084); Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China(BK20131450)

甲型(A)流感病毒属于正黏病毒科，根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨基酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性差异，可将甲型流感病毒可划分为不同的血清亚型，目前已鉴定出18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)[1-3]。甲型流感病毒宿主较为广泛，可以感染人和多种动物。目前有文献记载的可以感染人的禽流感病毒主要有H5、H9、H7和H10等亚型[4]。

自2014年以来，中国、老挝、越南等东南亚国家相继报道在禽类中出现H5N6亚型高致病性禽流感病毒，更为严峻的是在中国四川、广东及云南已发生3例人感染H5N6高致病性禽流感病毒危重病例[5]。H5N6禽流感病毒已给民众生计和动物安全构成严重威胁，对H5N6禽流感病毒进行跟踪监测具有非常现实的公共卫生意义。2013年，本研究从镇江市某活禽市场的环境样本中分离到一株H5N6亚型禽流感病毒，在全基因组序列基础上对病毒的基因起源和遗传特征进行分析。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂: 病毒RNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司；ExTaq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor, RANsin)和随机引物购自大连宝生物日本TaKaRa公司； Nextera XT DNA Sample Preparation Kit及Illumina MiSeq测序系统购自美国Illumina公司；Qubit® dsDNA HS Assay Kit购自美国Invitrogen公司；High Sensitivity DNA assay kit购自美国Agilent Technologies公司。

1.1.2引物: 依据A型流感病毒基因片段的核苷酸保守序列设计病毒通用引物：UFLUA-IF、UFLUA-IR用于扩增全基因组；逆转录引物：Uni12(M)[6]，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2方法1.2.1病毒分离: 标本由镇江市疾病预防控制中心提供，接种9-11日龄SPF鸡胚，37培养72 h，每天观察鸡胚生长情况。所有操作都在BSL-3级实验室内完成。1.2.2测序: 提取病毒基因组RNA，以U12反转录引物生成单链cDNA，通过A型流感病毒通用引物一步法扩增流感病毒基因组8个节段。将纯化的PCR产物定量后，稀释成0.2 ng/μl，按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit说明构建测序文库。步骤包括DNA的Tagmentation、PCR扩增、纯化、文库标化及混合。取800 μl混合样加入MiSeq测序试剂样品孔进行全基因序列测定。

1.2.3进化树构建: 采用CLC Genomics workbench(CLC Bio)对测序结果进行拼接整理，将序列用Blast进行同源性检索。MEGA6.0软件进行多序列比对，采用邻近归并法(Neighbor-Joining)法，构建系统发生树，用Bootstrap重复抽样1000次对进化树进行验证。

2　结果

2.1病毒分离处理好的标本接种鸡胚，24-72 h接种的鸡胚全部死亡，收获尿囊液，贮存于-70℃备用。尿囊液血凝效价为29；荧光RT-PCR检测，尿囊液甲型流感病毒M基因核酸阳性。分离株命名为A/ environment/ Zhenjiang/ C13/ 2013(en/c13)。

2.2基因来源分析通过2代测序平台，在标本SPF鸡胚接种物中，获得分离株en/c13的全基因组序列(8基因GenBank序列号分别为KJ938655-KJ938662)。通过BLASTn软件在线分析，初步确定分离株en/c13为H5N6亚型。为了探究病毒的基因来源，对分离株en/c13的8基因片段序列与参考株的核苷酸同源性进行比较分析，确认8个片段核苷酸最大相似性的参考株(表1)。分离株en/c13 NA基因核苷酸和推导的氨基酸序列与近年来中国流行的H6N6禽流感病毒(如 A/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)等)的同源性高达98%；而其他7个片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)核苷酸和推导的氨基酸序列与近年来东亚地区流行的H5N1流感病毒[如A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1), A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)等]的同源性都高达95%至99%。

NA基因进化树上，分离株en/c13与中国流行的H6N6毒株处于一个分支(图1)；其他7个片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)则与近年来流行的H5N1流感病毒处于一个进化分支上(图2)。对于HA基因片段进行比对后发现分离株en/c13与其核苷酸相似性最高的毒株均属于进化分支clade 2.3.4.4。自2010年以来，clade 2.3.4.4在我国的禽类中已颇为流行，成为H5亚型禽流感病毒的一个新的优势进化分支。

2.3基因分子特征分析在全基因组序列分析的基础上，对分离株en/c13编码蛋白关键氨基酸位点进行了分析。分离株en/c13 HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PLREKRRKR↓GLF，含有多个碱性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特性。HA蛋白的受体结合区226位和228位氨基酸没有发生突变(分别为Gln和Gly)，理论上对禽消化道上皮细胞α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)受体有亲嗜性。NA蛋白276(H→Y)和R294K(R→K)位点没有发生突变，保留了病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感。PB2蛋白的591位、627位和701位氨基酸分别为Gln、Glu和Asp，是典型的禽流感病毒分子特征。此外，NS-1蛋白的C末端具有ESEV基序，是禽流感病毒一个典型毒力分子标记。

图1　HA 基因进化树分析Fig.1　Phylogenetic tree for the HA gene

图2　NA基因进化树分析Fig.2　Phylogenetic tree for the NA gene

基因节段Genesegment亲缘关系最近的毒株Closestinfluenzavirusrelative核苷酸一致性(%)Nucleotideidentity(%)PB2A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)94.7PB1A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)96.7PAA/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)A/chicken/Vietnam/NCVD-KA423/2013(H5N1)A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)98.898.898.8HAA/wildduck/Shandong/628/2011(H5N1)96.9NPA/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)97.997.9NAA/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)97.7MA/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)A/wildduck/Fujian/2/2011(H5N1)99.099.0NSA/Muscovyduck/Vietnam/LBM634/2014(H5N1)A/muscovyduck/Vietnam/LBM636/2014(H5N1)98.598.5

3　讨论

基因重配是甲型流感病毒进化的分子机制之一。不同亚型或者不同宿主来源的流感病毒通过基因重配而产生的子代病毒，具有明显的选择优势，也是产生人类流感大流行病毒的一种主要方式[7]。自1996年在我国广东分离到高致病性H5N1禽流感病毒以来，该病毒对人类和动物健康造成持续的危害，其遗传进化也异常活跃[8]。本研究在禽流感环境监测中分离到一株H5N6病毒，基因分析表明该病毒是一株由H5N1和H6N6病毒重配的新病毒。研究结果证实H5N6病毒在我国华东地区也有流行，应进一步加强该地区的禽流感监测。

基因点突变是流感病毒进化的另一种重要机制[3]。禽流感病毒若要突破种属障碍成功跨种感染人，一些重要蛋白的关键氨基酸位点要发生相应的突变。分离株en/c13的HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特征，表明该病毒对家禽具有较大的危害。HA蛋白与宿主细胞表面受体的结合是感染发生的关键一步[9]。与HA蛋白结合的细胞受体有两类：α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)和α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)。禽类消化道主要表达SAα2-3Gal受体，而人呼吸道上皮细胞主要表达SAα2-6Gal受体，因此禽流感病毒跨物种感染人的首要前提是HA蛋白受体结合特性的转变。HA蛋白受体结合区的一些关键氨基酸位点在受体亲嗜性转变中起着关键作用，本研究中分离株en/c13的HA蛋白受体结合区的226和228位点没有发生突变，理论上对SAα2-6Gal受体的结合能力较弱，是典型的禽受体特征。此外，分离株en/c13的PB2蛋白627位点没有发生突变，表明该病毒在人体内复制能力较差。虽然分离株en/c13不具备感染人的某些分子特征，但病毒未来进化变异趋势值得关注，除了基因重配，持续的点突变也可能增强H5N6病毒对人体的感染能力，从而可能产生引起人类新的流感大流行毒株。

[1]Tong S, Zhu X, Li Y, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(10): e1003657.dio:10.1371/journal.ppat.1003657.

[2]Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats[J]. Proc Natl Acad Sci Acad USA, 2012, 109:4269-4274. doi:10.1073/pnas.1116200109.

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Molecular characterization analysis of one H5N6 subtype influenza virus

YuHuiyan,DengFei,WangShenjiao,HuoXiang,DaiQigang,QiXian

DepartmentofAcuteInfectiousDiseaseControlandPrevention,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

QiXian,Email:qixiansyc@hotmail.com

ObjectiveOne H5N6 subtype avian influenza virus, A/environment/ Zhenjiang/C13/2013, was isolated from environment in Zhenjiang in 2013 during epidemiological surveillance and was identified by HA/HI test and specific RT-PCR test. H5N6 AIV was subjected to genome sequencing to investigate the genomic composition. MethodsThe next-generation sequencing (NGS) Illumina MiSeq Platform was used to obtain complete genome sequence information from influenza virus isolates. MEGA6.0 software was used to align the eight fragments of the virus. The phylogenetic and molecular characteristics of the isolate were analyzed by Neighbor-Joining method. ResultsBlast searches demonstrated that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses currently circulating in China, whereas the other seven genes were found to be more similar to those of eastern Asian H5N1 AIV strains gene. The amino acid motif of cleavage site between HA1 and HA2 was PLREKRRKR↓GLF, which was the typical characteristics of the HPAIVs. The receptor binding site in the viral HA gene possesses the residues Gln 226 and Gly 228 (H3 numbering), indicating an avian-like receptor binding specificity. ConclusionOne H5N6 subtype avian influenza virus was isolated from environment, phylogenetic analysis showed that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses. The other seven genes belonged to H5N1 subtype. It suggests that strengthen the continuous surveillance of avian influenza A viruses is necessary.

Avian influenza virus; H5N6 subtype; gene reassortment

祁贤，Email：qixiansyc@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.006

江苏省医学重点人才基金(RC2011084)；江苏省自然科学基金(BK20131450)

2015-08-25)