EV71检测细胞系的构建与鉴定

闫江泓　吕新军　陶晓燕　于鹏程　吴未辰　李淑英　朱武洋

063000 唐山, 华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室(闫江泓、李淑英)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(吕新军、陶晓燕、于鹏程、吴未辰、朱武洋)



·技术方法·

EV71检测细胞系的构建与鉴定

闫江泓吕新军陶晓燕于鹏程吴未辰李淑英朱武洋

063000 唐山, 华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室(闫江泓、李淑英)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(吕新军、陶晓燕、于鹏程、吴未辰、朱武洋)

目的构建71型肠道病毒 (enterovirus 71, EV71)检测细胞系。方法以含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP为分子基础，构建GFP基因嵌入病毒基因组两端非编码区的表达盒UGFP，并将其克隆入质粒pLV-Puro获得慢病毒表达载体pLV-UGFP。将质粒pLV-UGFP和包装质粒Helper用脂质体转染法共转染入HEK293T细胞中，转染48 h后，用收集到的慢病毒颗粒感染BHK-21细胞，经嘌呤霉素压力筛选和系列稀释法获得用于外源EV71检测的工程细胞系BHK/UGFP。结果BHK/UGFP细胞感染EV71 48 h后，可检测到GFP的表达，作为对照组细胞感染甲病毒属的辛德毕斯病毒(XJ-160)和黄病毒属的乙脑病毒(P3)等单股正链RNA病毒，则检测不到绿色荧光。该检测细胞系用不同滴度的EV71感染，至少可以检测到10 PFU/ml的EV71。结论构建的BHK/UGFP检测细胞系可用于外源EV71的检测，且该检测方法特异性和灵敏性均良好。

【主题词】肠道病毒属； 工程细胞系

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China for“Control and Prevention of Major Infectious Diseases of China”(2014ZX10004-002)；National Science and Technology Infrustructure Program(2014BAI13B04)；National Natural Science Foundartion of China(31500152)

肠道病毒71型((enterovirus 71, EV71))是小 RNA 病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(entero-virus)的重要成员。EV71基因组全长约7500 bp，基因组两端为非编码区(Untranslated region, UTR)，编码的前体蛋白被2A和3C蛋白酶切割为四个结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4)和七个非结构蛋白(2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)[1]基因。EV71是手足口病(Hand-Foot-Mouse Disease)的主要病原体，可导致严重的中枢神经系统疾患，个别危重者甚至死亡。由于EV71的致病机制尚不清晰，目前尚无有效的抗病毒药物，EV71 4C基因亚型疫苗已完成前期临床试验，免疫应答作用较好。因而，建立早期快速的EV71诊断方法具有重要意义。

近年来，科研人员将报告基因序列引入到病毒基因组，通过缺失病毒某部分的特定元件成功构建病毒缺陷型复制子，由于缺失病毒正常复制和翻译的基因，将这种缺陷型复制子导入细胞后，缺陷型复制子只有通过某些特定病原体进入细胞通过反式作用引发一些列的病毒特异反应，进一步启动报告基因的表达。通过观察报告基因的表达情况，实现对某种病毒的检出，该方法从缺陷型复制子这一角度为病毒检测提供了一种简单、直观的新方法。Tzeng等构建了用于检测麻疹病毒的携带绿色荧光蛋白报告基因的缺陷型RNA复制子，检测结果显示特异性良好[2]。Hossain等构建并筛选了用于检测甲型流感病毒的含有荧光素酶报告基因的MDCK检测细胞系[3]。鉴于此，本研究以含有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因的EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP为分子基础，构建了可用于肠道病毒71型检测的、具有较好特异性和敏感性的工程细胞系。

1　材料与方法

1.1实验材料E.coliStbl 3感受态细胞购自索莱宝；大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)DH5α感受态细胞购于TaKaRa公司；含有EGFP基因的EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP为中国科学院生物物理研究所张立国研究员惠赠；BHK-21细胞、HEK293T细胞均为本室保存。

1.2试剂及工具酶T4DNA连接酶购自Promega公司；XhoI、BamHI等限制性内切酶购自Fermentas公司；pMD18-T克隆载体、DNA Marker、PCR相关试剂均为TaKaRa公司产品；凝胶回收试剂盒/PCR产物纯化试剂盒(QIAquick® Gel Extraction Kit/PCR Purification Kit)，小量质粒提取试剂盒(Qiagen Plasmid Mini prep Kit)和大量质粒提取试剂盒(Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit)购自Qiagen公司； X-tremeGENE HD Transfection Reagent转染试剂购于Roche公司；慢病毒载体pLV-Puro及其辅助质粒Helper为本科室保存；DAPI、G418、嘌呤霉素(Puromycin)、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清购于Gibco公司。

1.3构建UGFP基因过表达慢病毒载体以EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFPEGFP为分子基础，人工合成EGFP基因嵌入病毒基因组两端非编码区的表达盒UGFP，并在表达盒的两端加入XhoI、BamHI单一内切酶位点。将经XhoI /BamHI双酶切后的表达盒与慢病毒载体pLV-puro骨架用T4 DNA Ligase连接，连接产物转化到感受态细胞E.coliStbl3后经PCR鉴定和测序验证获得慢病毒表达载体pLV-UGFP(图1)。

1.4慢病毒颗粒包装和制备取2 μg成功构建的缺陷型慢病毒表达载体pLV-UGFP、3 μg包装质粒Helper，加入无血清无抗生素的DMEM培养基至终体积300 μl，再添加 6 μl PlusTMReagent，混匀后室温孵育15 min后加入X-tremeGENE HD Transfection Reagent转染试剂9 μl，置于室温孵育15 min，轻柔混合后，吸取液体均匀点滴至HEK293T细胞培养瓶中。转染48 h后，用移液管小心地吸取细胞瓶内的上清液，收集并分装至1.5 ml的EP管内，置于-80°C冰箱内备用。

1.5EV71检测细胞的筛选将收集好的慢病毒悬液感染BHK-21细胞，感染48 h后加入嘌呤霉素使培养液的终浓度为3 μg/ml压力筛选10 d，至无新的死亡细胞出现，将嘌呤霉素浓度降至1 μg/ml，继续扩大培养获得用于EV71检测的多克隆细胞株。用96孔板稀释法继续扩大培养，获得生长状态良好的单克隆细胞株，即为用于EV71检测的工程细胞系BHK/UGFP。

1.6EV71检测细胞系的特异性将BHK/UGFP细胞、正常的BHK-21细胞分别培养至24孔板内，分别感染200 μl感染复数为MOI=0.05的EV71和甲病毒属的辛德毕斯病毒(XJ-160)、黄病毒属的乙脑病毒(P3)等单股正链RNA病毒，病毒吸附1 h后，加入300 μl含2% 胎牛血清的DMEM维持液，在含5% CO2的37°C培养箱中继续培养48 h。用DAPI侵染细胞核后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因的表达情况。

1.7EV71检测细胞的灵敏性将处于对数生长期的BHK/UGFP细胞培养至24孔板内，分别感染病毒滴度分别为1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101和1PFU/ml的EV71。细胞被病毒感染48 h后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。

2　结果

2.1慢病毒表达质粒的制备以EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP为分子基础，将人工合成的表达盒UGFP克隆入质粒pLV-puro构建慢病毒表达载体，经酶切、菌落PCR鉴定阳性的重组质粒测序鉴定，测序正确的重组质粒即为用于EV71检测细胞系筛选的缺陷型慢病毒表达质粒，命名为pLV-UGFP。

2.2EV71检测细胞系BHK/UGFP的特异性分析为鉴定所制备细胞系的功能特征及其特异性，将经嘌呤霉素和96孔板系列稀释法筛选到的BHK/UGFP细胞和正常的BHK-21细胞，分别感染EV71和辛德毕斯(XJ-160)、乙脑(P3)等单股正链RNA病毒。检测结果显示，BHK/UGFP细胞感染EV71 48 h后，在荧光显微镜下可以观察到特异的绿色荧光，而正常的BHK-21组和辛德毕斯、乙脑病毒组则不出现绿色荧光(图2)。结果表明，筛选到的用于EV71检测的细胞系细胞BHK/UGFP能够检测到EV71病毒，且具有良好的特异性。

图2　BHK/UGFP的功能特性和检测特异性分析Fig.2　Function and specificity analysis of BHK/UGFP cells

图3　细胞系BHK/UGFP基础上EV71病毒检测方法的灵敏性分析Fig.3　Sensitivity of EV71 detection on the basis of BHK/UGFP cells

2.3EV71检测细胞系BHK/UGFP的灵敏性分析为对细胞系BHK/UGFP基础上EV71检测方法的灵敏性加以分析，用BHK/UGFP细胞感染不同滴度的EV71，细胞感染病毒48 h后，检测结果表明，当细胞感染的病毒滴度下降为1 PFU/ml时就不能观察到GFP的表达，而当细胞感染EV71的滴度为10 PFU/ml及以上时则可以在荧光显微镜下观察到特异的绿色荧光。本研究结果表明，用于EV71检测的工程细胞系BHK/UGFP至少可以检测出滴度为10 PFU/ml以上的EV71，其灵敏度介于1-10PFU/ml之间(图3)。

3　讨论

随着对病毒基因结构及功能的深入研究，工作人员发现可以将报告基因插入到病毒基因组中，利用病毒独特的复制、翻译机制，开发了多种病毒复制子载体用以表达报告基因和目的蛋白[4,5]。在这种策略的基础上，缺失病毒基因组的某些必须基因，使其缺失病毒正常复制和翻译的功能，进而构建携带报告基因的重组缺陷型复制子载体，将其导入细胞后无法正常表达，当相应的外源病毒感染细胞时才能启动报告基因的表达，从而根据荧光蛋白信号的有无，来判断样本中是否有相应病毒的感染[6,7]。

EV71感染在婴幼儿中引发的手足口病已经成为一种严重的传染病，并呈逐年升高的趋势。近年来对于EV71感染引发HFMD的发生发展过程还不清楚，且有效的治疗方法匮乏，常导致严重的临床后果，因此明确HFMD病原，建立针对EV71的早期快速检测方法非常重要。据此，本研究以含有绿色荧光蛋白基因的EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP为分子基础，构建了含有GFP和EV71启动序列修饰的工程细胞系BHK/UGFP，用于肠道病毒71型的检测，以该缺陷型细胞系为基础的检测方法具有较好的特异性和敏感性。这种新的检测策略避免了标本核酸提取等繁琐的操作，可在48 h左右得出结果。另一方面，本检测方法只需将样本加入到细胞，而无需灭活，这样更有力于相关病原体的后续研究。

[1]Lin JY, Chen TC, Weng KF, et al. Viral and host proteins involved in picornavirus life cycle[J]. J Biomed Sci, 2009, 16(1): 103. doi: 10.1186/1423-0127-16-103.

[2]Tzeng WP, Zhou Y, Icenogle J, et al. Novel replicon-based reporter gene assay for detection of rubella virus in clinical specimens[J]. J Clin Microbiol,2005,43(2):879-885. doi:10.1128/JCM.43.2.879-885.2005.

[3]Hossain M J, Perez S, Guo Z, et al. Establishment and characterization of a Madin-Darby canine kidney reporter cell line for influenza A virus assays [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(7): 2515-2523. doi:10.1128/JCM.02286-09.

[4]Quetglas J I, Ruiz-Guillen M, Aranda A, et al. Alphavirus vectors for cancer therapy[J]. Virus Res,2010, 153(2): 179-196. doi:10.1016/j.virusres.2010.07.027.

[5]Alcaraz-Estrada SL, Reichert ED, Padmanabhan R. Construction of self-replicating subgenomic West Nile virus replicons for screening antiviral compounds[J]. Methods, 2013,1030: 283-299.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_22.

[6]Kung SH, Wang YC, Lin CH, et al. Rapid diagnosis and quantification of herpes simplex virus with a green fluorescent protein reporter system[J].J Virol Methods, 2000,90(2): 205-212.doi:10.1016/S0166-0934(00)00234-2.

[7]Li J, Zhu W, Wang H, et al. Rapid, specific detection of alphaviruses from tissue cultures using a replicon-defective reporter gene assay[J].PloS One,2012,7(3):e33007. doi.org/10.1371/journal.pone.0033007.

Construction and identification of the cell line for detecting Enterovirus 71

YanJianghong,LyuXinjun,TaoXiaoyan,YuPengcheng,WuWeichen,LiShuying,ZhuWuyang

HebeiKeyLaboratoryforChronicDiseases,TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases,SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China(YanJH，LiSY);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(LyuXJ,TaoXY,YuPC,WuWC,ZhuWY)

LiShuying,lsy5001@sina.com；ZhuWuyang,Email:zhuwuyang1971@sina.com

ObjectiveTo select and identify the cell line for detecting Enterovirus 71 (EV71). MethodspWSK-T7-EV71-GFP containing green fluorescent protein (GFP) gene is an infectious clone for EV71, based on which the UGFP cassette was constructed by inserting GFP gene into 5′ and 3′ untranslated region (UTR) of the genome of EV71. The lentiviral expression plasmid pLV-UGFP containing UGFP was constructed on the basis of pLV-Puro, a lentiviral vector. To obtain lentivirus, pLV-UGFP plasmids were transfected together with the packaging plasmids into HEK293T cells by liposomes. Then, the target cells BHK-21 were infected with the lentivirus particles. Puromycin-resistant cell colonies were detached from the 6 well-plate and sub-cloned by use of 96 well-plate. Finally, we selected the packaging cell lines that could express the defective replicons stably, named BHK/UGFP cells. ResultsGFP expression assays indicated that BHK/UGFP cells infected with EV71 could express GFP at 48 hours post-infection, while no green fluorescence was observed after BHK/UGFP cells were infection with Sindbis virus (SINV, XJ-160) or Japanese encephalitis virus (JEV, P3), demonstrating that the selected cells could specifically detect EV71 infection. The sensitive assay results indicated that this method on the basis of BHK/UGFP cells could at least detect 10 PFU/ml of EV71 in tissue culture. ConclusionThis result indicated that the BHK/UGFP cells selected in this study were specific and effective to detect EV71 from tissue culture.

Enterovirus； Cell lines

李淑英，Email：lsy5001@sina.com；朱武洋，Email:zhuwuyang1971@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.016

艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项(2014ZX10004-002)；国家科技支撑计划(2014BAI13B04)；国家自然科学基金(31500152)

2016-03-08)