响应面法优化Tween-80超声提取藤茶二氢杨梅素工艺*

王延伟，郭　倩，陈　冬，陈　丹，徐秀泉

(江苏大学药学院，江苏　镇江　212013)



响应面法优化Tween-80超声提取藤茶二氢杨梅素工艺*

王延伟，郭倩，陈冬，陈丹，徐秀泉

(江苏大学药学院，江苏镇江212013)

利用响应面法优化藤茶中二氢杨梅素的提取工艺。在单因素试验基础上，选取Tween-80浓度、超声时间和超声温度为自变量，二氢杨梅素得率为响应值，进行Box-benhnken中心组合实验设计，运用响应面设计法优化提取条件。获得最优提取条件为：料液比30 mL/g，Tween-80浓度6.8%，超声温度54 ℃，超声时间29 min，藤茶中二氢杨梅素的提取得率为355.8 mg/g，理论值为353.7 mg/g，RSD为0.59%。采用响应面设计方优化的藤茶中二氢杨梅素Tween-80协同超声提取工艺方法可行，结果可靠。

藤茶；二氢杨梅素；超声提取；Tween-80；响应面法

二氢杨梅素是富含于藤茶(Ampelopsisgrossedendata)幼嫩茎叶中具多酚羟基的二氢黄酮醇类化合物[1]。现代药理学表明，二氢杨梅素具有显著的抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗阿兹海默症等生理活性[2-4]，极具开发价值。从藤茶中提取二氢杨梅素多采用溶剂加热回流方法[5]，该方法周期长、温度高、效率低、有机溶剂消耗严重，寻求高效的提取方法是目前研究的热点之一。超声提取技术是利用超声波的空化效应、机械效应和热效应，能够提高植物细胞的通透性，可加速有效成分的溶出，具有提取效率高、时间短等优点，广泛应用于中药活性成分的提取领域[6]。表面活性剂具有双亲结构，能显著降低溶液的表面张力，增强溶剂对中药材的渗透作用，对中药材中的有效成分具有增溶作用，表现出良好的提取效率[7]。本文拟综合二者的优势，首次利用Tween-80表面活性剂体系结合超声提取方法，采用响应面试验法优化Tween-80协同超声提取藤茶中二氢杨梅素的工艺，探索高效提取藤茶中二氢杨梅素的有效方法。

1　实　验

1.1材料与仪器

藤茶购自张家界旺盛商贸有限公司，经江苏大学药学院汤建副教授鉴定为葡萄科植物显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata的干燥茎叶，粉碎过60目筛备用；二氢杨梅素对照品，南京泽朗有限公司；色谱纯甲醇，苏州天可贸易有限公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯；试验用水为双蒸超纯水。

LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；KQ-250DB数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；BSA124S型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；Pico型超速离心机，美国热电公司。

1.2实验方法

1.2.1二氢杨梅素含量测定方法的建立

精密称取定量干燥至恒重的二氢杨梅素对照品于量瓶中，加适量色谱甲醇溶解，定容至刻度，得0.48 mg/mL的对照品溶液。分别精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL该溶液，置于10 mL量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，得系列浓度对照品溶液。按照下列色谱条件进行测定[8]： Kromasil C18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，甲醇-水-磷酸(27:73:0.2)为流动相，流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃，检测波长: 292 nm，进样体积:20 μL。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线方程：y=11738x-4052，R2=0.9997，结果表明在9.6～96 μg/mL范围内对照品浓度与峰面积呈现良好的线性相关。

1.2.2藤茶中二氢杨梅素的提取得率测定

精密量取1.0 mL藤茶提取液用色谱甲醇稀释到一定倍数，0.45 μm微孔滤膜过滤后，按照1.2.1色谱条件，进样检测，计算二氢杨梅素提取得率。

1.2.3响应面设计

在单因素试验的基础上，以Tween-80浓度(X1)、超声时间(X2) 、超声温度(X3) 三个因素为自变量，以二氢杨梅素得率为响应值，采用Design-Expert. 8.05 软件中的Box-Behnken Design试验设计方法进行设计。各因素水平及编码见表1。

表1　响应面分析因子及水平表

2　响应面试验设计及结果

由单因素试验结果可知，料液比对二氢杨梅素得率影响不大，因此固定料液比1:25，以Tween-80浓度、提取时间和温度为自变量，二氢杨梅素得率为响应值，设计3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，其中12个为析因试验，3个为中心试验。试验设计与及结果见表2。

表2　响应面分析试验设计及结果

续表2

710-1293.78101316.390-1-1323.6100-11341.41101-1318.912011325.413000354.414000348.615000350.1

表3　回归模型方差分析

注：*表示显著(0.05>P>0.01)，**表示高度显著(0.01>P>0.001)，***表示极显著(P<0.001)。

运用Expert-design 8.05中的RSR(response surface repression)程序对15个试验点的响应值进行回归分析，得到Tween-80浓度、超声提取时间和温度对响应值的回归方程为：

回归方程方差分析结果见表3。由方差分析可知，该回归方程的确定系数R2为0.9866，方程的F值为40.98均达到极显著水平，说明回归方程拟合良好；调整确定系数R2Adj为0.9626，说明该数学模型能解释96.26%的响应值变化。

由P值可以分析各因素对响应值的影响程度。一次项中，Tween-80浓度、提取时间和温度对二氢杨梅素得率的影响均高度显著；二次项中，Tween-80浓度对二氢杨梅素得率的影响极显著，提取时间和温度对二氢杨梅素得率的影响均高度显著；交互项X1X2、X1X3、X2X3均未达到显著水平。

三维响应面图可以用来反应单因素对响应值的影响，若曲面坡度平缓，说明该因素对响应值影响较小，若曲面坡度陡峭，则该因素对响应值影响较大。根据表1结果，绘制响应面为图2(A～C)。

图2　各交互作用对藤茶二氢杨梅素得率影响的响应面

由图2(A)可知，二氢杨梅素得率随Tween-80浓度的增加迅速提高而后慢慢降低，曲面坡度较提取时间的变化更为陡峭，这与单因素试验结果一致，说明Tween-80浓度较提取时间对二氢杨梅素得率的影响更为显著。Tween-80为非离子型表面活性剂，在水中形成微胶团降低溶剂的表面张力，提高二氢杨梅素在体系中的溶解度，所以Tween-80浓度增加，形成的微胶团越多，对二氢杨梅素的增溶作用越强，但是浓度增加到一定程度，会增加溶剂的粘度，阻碍二氢杨梅素的溶出。在图2(B)中，二氢杨梅素得率随Tween-80浓度和超声温度的变化均为先显著增加后显著降低，两因素的曲面坡度都非常陡峭，说明二者均对二氢杨梅素得率具有显著影响，在一定范围内提高Tween-80浓度和超声温度能够增加微胶团的数目，加速溶剂的运动速度，提高二氢杨梅素得率，但是温度过高，将导致微胶团起浊破裂，Tween-80增溶作用大大降低，致使二氢杨梅素得率的大大降低。在图2(C)中，两因素的曲面坡度均较平缓，说明固定了Tween-80浓度之后，在选定的范围内，二者对二氢杨梅素得率的影响小于Tween-80浓度的变化。

根据所得模型，获得藤茶中二氢杨梅素超声提取的最优工艺条件：固定料液比30 mL/g，Tween-80浓度为6.8%，超声温度54 ℃，超声时间29 min，理论值为353.7 mg/g，进行三次验证试验，藤茶中二氢杨梅素的提取得率为355.8 mg/g，与理论值非常接近，RSD为0.59%，。可见通过响应面法建立的回归模型具有较高的可靠性，优化工艺可行。

3　结　论

藤茶中富含的二氢杨梅素是值得深入研究的高活性化合物。本文综合了超声辅助提取和表面活性剂提取的优点，利用单因素和响应面分析法优化了藤茶中二氢杨梅素的最优提取工艺：固定料液比30 mL/g，Tween-80浓度为6.8%，超声温度54 ℃，超声时间29 min，二氢杨梅素得率可达355.8 mg/g，与理论值的相对误差很小，充分说明了提取工艺的可靠性。采用响应面设计方优化藤茶中二氢杨梅素Tween-80协同超声提取工艺方法可行，绿色环保，为进一步开发二氢杨梅素具有很大的实际应用价值。

[1]曹敏惠, 谢一萍,倪德江. 藤茶中二氢杨梅素的绿色提取纯化方法研究[J]. 食品科技, 2011, 36(6): 230-233.

[2]YeLY, Wang HJ,Sean F.O’Keefe, et al.Antioxidant activities of Vine Tea (Ampelopsis grossedentata) extract andits major component dihydromyricetin in soybean oil and cookedground beef[J].Food Chem,2015, 172: 416-422.

[3]Xia J,GuoShW, Zhu RZH, et al.Dihydromyricetin induces autophagy in HepG2 cells involvedin inhibition of mTOR and regulating its upstream pathways[J].Food Chemi Toxicol, 2014, 66: 7-13.

[4]Liang J, A. Kerstin Lindemeyer, Shen Y, et al.Dihydromyricetin Ameliorates Behavioral Deficits and ReversesNeuropathology of Transgenic Mouse Models of Alzheimer’s Disease[J].Neurochem Res,2014, 39: 1171-1181.

[5]Xie YF, Chen ZHH, Lv HCH, Optimization of Extraction Technology for Dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata by Response Surface Analysis Methodology[J].Chin J Exp Tradit Med Form, 2012, 18(17): 46-49.

[6]Chen MSH, Zhao Y, Yu SHJ, et al. Optimisation of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds,antioxidants, and anthocyanins from sugar beet molasses[J].Food Chem, 2015, 172: 543-550.

[7]Wenjuan Xing, Ligang Chen. Micelle-mediated extraction and cloud point preconcentrationofbergeninfrom Ardisia japonica[J].Sep Purif Technol, 2013, 110: 57-62.

[8]Jin MY, Ding Y, Zhang T, et al. Simultaneous Determination of Dihydromyricetin and Resveratrol in Ampelopsis sinica (Miq.) W.T. Wang by High-Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode Array Detection [J]. Method J Chromatogr Sci, 2014, 52: 339-343.

Optimization of Ultrasonic-assisted Tween-80 Mediated Extraction of Dihydromyricetin fromAmpelopsisgrossedendataby Response Surface Methodology*

WANG Yan-wei, GUO Qian, CHEN Dong, CHEN Dan, XU Xiu-quan

(School of Pharmacy, Jiangsu University, Jiangsu Zhenjiang 212013, China)

A noval method based on ultrasonic-assisted Tween-80 mediated extraction was developed for the extraction of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata. The non-ionic surfactant Tween -80 was chosen as extraction solvent. The key parameters including the concentration of Tween-80, ultrasonic temperature and time were optimized by response surface methodology. The optimum conditions were determined as 6.8%(V/V) aqueous Tween-80, ultrasonic temperature of 54 ℃, ultrasonic time of 29 min and meterial-liquid ratio of 1:25 for the highest dihydromyricetin content of 355.4 mg/g. The experimental values were well agreed with the predicted 353.7 mg/g with 0.59% of RSD. The results showed that the response surface methodology was useful for optimizing the Tween-80 mediated extraction of dihydromyricetin fromAmpelopsisgrossedendata.

Ampelopsis grossedentata; dihydromyricetin; ultrasonic-assisted extraction; Tween-80 mediated; response surface methodology

江苏省中医药管理局项目(LZ13244)；江苏省博士创新项目(CXLX13-686)；江苏省大学生创新项目(201410299084X)；江苏大学大学生科研立项项目(13A169)。

王延伟(1993-)，硕士研究生。

徐秀泉(1978-)，博士。

R284.2

A

1001-9677(2016)016-0063-03