猪IL-18增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫效果的研究

韩 丽，何潇湘,，王瑞宁，曹贝贝，耿静微，陈红英,，魏战勇,

(1. 河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2. 河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州450002)

猪IL-18增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫效果的研究

韩 丽1，何潇湘1,2，王瑞宁2，曹贝贝1，耿静微2，陈红英1,2，魏战勇1,2

(1. 河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2. 河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州450002)

为了研究猪白细胞介素18是否增强猪细小病毒(PPV)灭活疫苗在猪体免疫效果，分别将猪白细胞介素18与自制猪细小病毒灭活疫苗和猪细小病毒灭活疫苗联合免疫仔猪，并设猪白介素18和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示，免疫后猪白细胞介素18联合灭活疫苗组抗体水平与无猪白介素18灭活疫苗组相似，但免疫后猪白介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞所占比值均高于相应的PPV灭活疫苗组，但差异不显著,且CD4+/CD8+在正常范围内。研究证实猪白介素18主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。

猪白细胞介素18；猪细小病毒；灭活疫苗

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)感染引起的妊娠母猪繁殖障碍性疾病。该病毒主要导致初产母猪出现不孕、流产、产死胎、木乃伊胎及弱胎等临床症状。猪细小病毒病广泛存在并流行于世界各地养猪场，严重制约了养猪业的发展，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。PPV的感染尚无有效的治疗方法，疫苗免疫预防仍是控制该病的主要手段。目前，PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因工程活病毒载体疫苗等，其中灭活疫苗具有安全性好、产生抗体时间长、不需要低温保存的优点；弱毒疫苗免疫效力较强、产生抗体快、用量少、成本低，但安全性较差；基因工程亚单位疫苗免疫源性较好，但成本和技术要求都比较高；基因工程活病毒载体疫苗可以同时预防两种病或多种病的、能够诱导较强的免疫反应，但生产技术复杂、 成本较高；基因疫苗生产工艺简单、免疫剂量小、成本低廉、可构建多基因或多价疫苗，但其安全性受到广泛关注[1-3]。目前使用最广泛的猪细小病毒病疫苗是灭活疫苗。灭活疫苗具有安全性好、保护力持久等优点，但也存在免疫应激强、有效免疫抗体产生慢、引起细胞免疫弱甚至无法引起细胞免疫等诸多问题。因此，开发一种安全、高效的灭活疫苗免疫增强剂对猪细小病毒病的防制至关重要。猪白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是在一种具有多种生物学活性的蛋白质[4]。它既能增强抗原的免疫原性，又能作用于体内免疫细胞，促进其分化、增殖，具有较好的疫苗免疫佐剂效应，在提高免疫应答水平方面发挥着重要作用，是一种重要的细胞免疫调节因子。IL-18能使HBV核酸疫苗诱导的免疫反应向Thl型为主的细胞免疫反应转变，并增强特异性的CTL反应[5]。故可以用IL-18联合PPV灭活疫苗来增强猪体的细胞免疫，从而弥补灭活疫苗的不足。由于IL-18可通过对IFN-γ的诱导作用，促进MHC I类分子的表达,因此可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果[6]。本实验通过PPV特异性IgG抗体、猪外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞亚群百分数指标的检测，研究了其对猪体免疫效果的影响，为新型免疫增强剂的开发提供了理论基础和试验依据。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器

猪细小病毒ELISA诊断试剂盒(PPV ELISA KIT 96T,NC27606 USA)购自BioXL公司；Multiskan MK3型酶标仪购自Therm公司)；FACsort流式细胞仪(Becton Dickinson,USA)；大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群单克隆抗体以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记兔抗大鼠IgG抗体购自北京邦定泰克生物技术有限公司。

1.2疫苗

猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自中牧实业股份有限公司(批号1009006-2)；自制猪细小病毒油乳剂灭活疫苗，灭活病毒的血凝(HA)效价为1∶29。

1.3猪白细胞介素18

由河南省动物性食品安全重点实验室构建的重组质粒pcDNA-IL18，已经被证实具有一定的生物学活性[7]。经试验测定，猪白细胞介素18免疫仔猪的最佳免疫剂量为2 mL·头-1。

1.4安全性检验

1.4.1 小鼠的安全性检验 取10 d SPF健康昆明乳鼠15只，分3组，每组5只。将自制猪细小病毒油乳剂灭活疫苗和猪白介素18分别皮下接种每组小鼠，每只0.1 mL，另外1组设不接种对照组。观察2周，看是否出现不良反应；如无异常则证明该疫苗和白介素18对乳鼠安全。

1.4.2 仔猪的安全性检验 取PPV阴性健康仔猪9头，分3组，每组3头。将自制猪细小病毒油乳剂灭活疫苗及猪白细胞介素18分别肌肉注射每组仔猪，每头接种10 mL，另外1组设不接种对照组。观察2周，看是否出现不良反应。如无异常则证明该疫苗和白介素18对仔猪安全。

1.5试验动物及免疫

试验所用30头35日龄断奶仔猪(由郑州市某猪场提供)随机分为6组，每组5头，经ELISA检测，PPV抗体阴性。试验分组及免疫情况见表1。

1.6特异性抗体水平测定

应用间接ELISA方法，按照猪细小病毒ELISA诊断试剂盒(BioXL)说明书用试剂盒检测仔猪血清中PPV特异性IgG抗体。

1.7外周血T淋巴细胞亚群测定

免疫后0、1、2、3、4周，每组分别随机挑选2头仔猪，前腔静脉采血2 mL于含柠檬酸钠抗凝剂的采血管中，分离淋巴细胞并计数，用无菌PBS溶液将细胞浓度调至5.0×106个·mL-1。用流式细胞仪检测分别检测其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞亚群含量。

表1 试验分组及免疫情况Table 1 Grouping and vaccination of tested pigs

2 结果与分析

2.1安全性检验结果

2.1.1 小鼠安全性检验 接种小鼠观察2周，小鼠精神食欲正常，无不良反应，注射部位没有出现红肿，瘙痒，破溃等局部反应。

2.1.2 仔猪安全性检验 接种健康仔猪观察2周，猪群体温正常、采食、精神正常，注射部位未发现肿块，无不良反应。证明该自制疫苗和白细胞介素18对仔猪安全。

2.2特异性抗体水平测定

采用PPV诊断试剂盒分别对每周采集分离的血清进行PPV特异性IgG抗体水平的检测，对各试

验组所测数据进行统计学分析，得到猪细小病毒IgG抗体消长的规律(图1)。从图1可以看出，免疫后各疫苗组IgG抗体水平均逐渐上升，并在第4周达到峰值，猪白细胞介素18组及生理盐水组抗体水平无显著变化。免疫后第3～5周，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的抗体效价高于相应的灭活疫苗免疫组，但差异不显著。灭活疫苗免疫组的抗体水平与生理盐水对照组差异显著(P<0.05)，猪白细胞介素18对照组与生理盐水对照组差异不显著。

疫苗接种后时间/周Time after vaccination

2.3外周血T淋巴细胞亚群动态变化

2.3.1 免疫仔猪外周血CD3+T淋巴细胞动态变化 免疫后各组CD3+T淋巴细胞百分比值均出现了动态的变化(如图2-A)。从图2-A可见，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗的CD3+T淋巴细胞的所占比值高于相应的无猪白细胞介素18 PPV灭活疫苗组，但差异不显著(P>0.05)。在免疫后第3～4周，各免疫组与生理盐水对照组差异显著(P<0.01)。

疫苗接种后时间/周Time after vaccination

2.3.2 免疫仔猪外周血CD3+CD4+T淋巴细胞动态变化 免疫后各组CD3+T淋巴细胞百分比值均出现了动态的变化(如图2-B)。从图2-B可见，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3+CD4+T淋巴细胞所占比值高于相应的无猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组，猪白细胞介素18对照组高于生理盐水对照组，但差异均不显著(P>0.05)。

2.3.3 免疫仔猪外周血CD3+CD8+T淋巴细胞动态变化 免疫后各组CD3+T淋巴细胞百分比值均出现了动态的变化(如图2-C)。从图2-C可见，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3+CD8+T淋巴细胞所占比值高于相应的无白细胞介素18 PPV灭活疫苗组，猪白细胞介素18对照组高于生理盐水对照组，但差异均不显著(P>0.05)。

2.3.4 免疫仔猪外周血CD4+/CD8+淋巴细胞动态变化 CD4+/CD8+的正常比值范围为1.0～2.87，过高或过低都反映机体免疫功能紊乱。从图3可见，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的(CD4+/CD8+T淋巴细胞比值)均趋于正常范围，说明没有对机体免疫功能造成坏的影响。

疫苗接种后时间/周Time after vaccination

3 讨论

IL-18能诱导淋巴细胞产生IFN-γ[8]，IFN-γ是IL-18诱导抗病毒免疫的介导因子[9]。IL-18可通过诱导CD4+、CD8+T淋巴细胞而明显提高细胞免疫和体液免疫功能，从而有效地发挥IL-18的免疫佐剂作用。而且，IL-18能够促进Th1类细胞因子的表达,促进机体诱导特异性Th1细胞和CTL细胞反应，增强机体的特异性细胞免疫功能[5]。IL-18还能显著提高T淋巴细胞的转化率，提高机体的细胞免疫水平。IL-18的早期应用还能起到防御病毒入侵和保护心肌的作用[10]。因此，本试验就通过用猪白介素18作为免疫增强剂来增强猪细小病毒灭火疫苗在猪体的细胞免疫功能。

间接ELISA方法检测免疫后仔猪血清PPV抗体动态变化，结果显示猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组抗体效价均高于相应的灭活疫苗单独免疫组，并呈持续增长趋势，在第3、4周抗体效价显著增高(P<0.05)。猪白细胞介素18单独免疫组的抗体效价在免疫后第4-6周上升比生理盐水对照组高。结果表明，猪白细胞介素18能够增强PPV灭活疫苗的体液免疫应答强度。

T淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的重要成分。CD3分子是存在于所有成熟T淋巴细胞膜表面的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志，其主要功能是传递T细胞活化信号[11-12]。CD4+T淋巴细胞是免疫系统的主要调节细胞，能分泌多种细胞因子，具有诱导和增强免疫应答的作用[13-14]。CD3+、CD4+淋巴细胞亚群激活后可增殖分化为Th1和Th2 效应细胞，并通过表达不同的细胞因子介导各自的免疫功能[13-15]。本研究利用流式细胞技术检测免疫后各组仔猪脾脏T淋巴细胞亚群的动态变化，评价猪白细胞介素18对PPV灭活疫苗的细胞免疫水平的影响。结果显示，猪白细胞介素18 联合PPV灭活疫苗组的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞所占比值均高于相应的PPV灭活疫苗免疫组。免疫后21～28d，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗试验组的CD4+T淋巴细胞数与相应的灭活疫苗单独免疫组差异显著(P<0.05)。免疫后第21天，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的CD8+T淋巴细胞所占比值比相应的灭活疫苗单独免疫组高，且差异显著(P<0.05)。从本研究的CD4+、CD8+T淋巴细胞比值变化情况看，CD4+T淋巴细胞在猪白细胞介素18增强细胞免疫应答中发挥着重要作用，表明猪白细胞介素18佐剂主要通过CD4+T淋巴细胞介导作用增强仔猪的细胞免疫应答。各免疫组免疫仔猪后，猪白细胞介素18联合PPV灭活疫苗组的CD4+、CD8+T淋巴细胞比值比相应的灭活疫苗单独免疫组高。研究结果表明，白细胞介素18能够提高PPV油乳剂灭活疫苗的体液免疫水平细胞，同时还能增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答强度，证明猪白细胞介素18能够被用作PPV油乳剂灭活疫苗的免疫增强剂。

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(责任编辑：蒋国良)

Enhancingimmuneresponsestoinactivatedporcineparvovirusoilemulsionvaccinebyco-inoculatingporcineinterleukin18inporcine

HAN Li1, HE Xiaoxiang1,2, WANG Ruining2, CAO Beibei1, GENG Jingwei2, CHEN Hongying1,2, WEI Zhanyong1,2

(1. College of Animal Husbaudry and Veterinary Science， Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China； 2. Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

The objective of this study is to characterize the enhancing immune responses to inactivated porcine parvovirus(PPV) oil emulsion vaccine by co-inoculating porcine interleukin 18 (IL-18) in porcine. In this study, the immunogenicity of PPV vaccine and the immuno-regulatory activities of IL-18 were investigated. The inactivated PPV vaccines with or without IL-18 were inoculated into piglet by subcutaneous injection. Then humoral and cellular immune responses were evaluated by indirect enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA) and fluorescence-activated cell sorter analyses (FACS). The results demonstrated that after immunity, the swine IL-18 joint inactivated vaccine group antibody levels were similar to inactivated vaccine without IL-18, and the T lymphocyte ratio of swine IL-18 joint PPV inactivated vaccine group CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+were higher than PPV inactivated vaccine group,but the difference was not significant. In conclusion, these results suggest that IL-18 possess better cellular immune-enhancing capability and can be exploited into an effective immune-adjuvant for inactivated vaccines.

porcine interleukin 18; porcine parvovirus; inactivated vaccine

S852.4

：A

2015-12-12

河南省重大科技攻关项目(132102110034)；河南省科技开放合作项目(142106000042)

韩 丽(1989-)，女，河南南阳人，硕士研究生，主要从事动物分子病毒学研究。

魏战勇(1975-)，男，河南安阳人，教授，硕士生导师。

1000-2340(2016)02-0224-05