含1,3,4-噻二唑硫脲类新型化合物的合成及对植物病害抗性的分析

宋海龙，赵钰泽，王彩霞,2,周 祁，刘卫群,

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州450002； 2.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002；3.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

含1,3,4-噻二唑硫脲类新型化合物的合成及对植物病害抗性的分析

宋海龙1，赵钰泽3，王彩霞1,2,周 祁3，刘卫群1,3

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州450002； 2.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002；3.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

为了得到高性能的抗植物原害化合物，以氨基硫脲为起始原料，经环化、烷基化，得中间产物5-S-烃基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基异硫氰酸苯酯反应，合成了2种新化合物(4a，4b)，其化学结构表征通过红外光谱(IR)，核磁共振氢谱(1H-NMR)和核磁共振碳谱(13C-NMR )的检验符合4a，4b分子表征，采用高分辨质谱(HRMS)分析了4a，4b的相对分子质量，与计算值基本相等，表明4a，4b化合物完全与设计的分子结构一致。抗菌检验结果表明，在200 mg·L-1及100 mg·L-1质量浓度下，化合物4a，4b对新月弯孢菌、棉枯萎镰刀菌、烟草黑胫菌和禾谷镰孢菌的抑制率均高于对照药剂三唑酮；对烟草花叶病毒(TMV)抗性测试结果显示，在500 mg·L-1质量浓度下，化合物4b对TMV预防抑制率达到78.38%，比宁南霉素提高25.44%。

硫脲类化合物；烟草；合成；生物活性

在植物真菌病害、细菌病害和病毒病害中，病原真菌引起的约占病害总数的70%～80%，每年因真菌病害引起的作物产量损失很大[1]。尽管不断有新的抗菌剂研制出来，但易抗药性使得新药的研制仍是一项十分重要的任务。“病毒病害”有植物癌症之称，几乎每种农作物都受到一种或多种病毒病的危害，给农业生产带来巨大的威胁。其中，烟草花叶病毒(TMV)是一种典型的花叶病毒，可侵染38科268种植物。据估计，仅烟草花叶病毒引起的花叶病每年全世界损失达l亿美元以上[2]。目前，已经商品化的抗烟草花叶病毒药剂如病毒必克、植病灵、井冈霉索A、宁南霉素等的大田防效在30%～60%,不能有效抑制植物病毒所造成的危害，而且有的药剂(如病毒唑)还有药害。这就使得创制高效、低毒、高选择性、环境相容性好的抗植物病毒治疗剂成为当务之急。硫脲类衍生物在新农药研究、开发和商业化中显示了十分重要的作用。到目前为止,国外的一些药物公司相继成功地开发了数十个硫脲类的农药新品种，如作为杀菌剂的代菌灵、杀虫剂的螟蛉畏、杀螨剂的杀螨隆、植物生长调节剂的呋苯硫脲、杀鼠剂安妥等。在近十几年的农药或医药领域内,大量文献进一步报道了硫脲类化合物具有杀菌[3-4]、杀虫、除草[5-6]、植物生长调节[7-8]和抗癌[9-11]等广泛的生物活性。另外，硫脲类化合物还有抗病毒作用。德国SCHUSTER等于1991年首次将硫脲类化合物用于植物病毒的研究，发现烯丙基硫脲衍生物对TMV，CMV有抑制作用[12]。 1,3,4-噻二唑衍生物因同样具有广泛生物活性[13-16]，在杂环农药中扮演着重要的角色，例如，杀菌剂中防治水稻白叶枯病的叶青双，作为除草剂的氟他胺都含有噻二唑环。日本的NOGUCHI等[17]最早报道了噻二唑衍生物还具有抗植物病毒活性。为了得到高活性的抗菌和抗病毒试剂,本研究利用生物等排原理和活性拼合等药物设计基本原理,将用硫醚基团修饰的1,3,4-噻二唑环和硫脲基团进行活性拼接，以氨基硫脲为起始原料，经环化、烷基化，得中间产物5-S-烃基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基异硫氰酸苯酯反应，合成2种新的化合物N-(4-三氟甲基)苯基-N′-(5-S-烃基-1，3，4-噻二唑-2-基)硫脲,并对其结构进行表征，对其抗菌及抗病毒活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1 供试植物病原真菌 新月弯孢菌(Curvularialunata)、棉花枯萎病菌(Cottonfusarium)、烟草黑胫菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)，由河南农业大学植保学院提供。

1.1.2 供试植物与供试病毒 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)枯斑寄主为珊西烟(Nicotianatabacumcv.xanthinc)，由中国农业科学院烟草研究所提供；烟草花叶病毒(TMV)由贵州大学提供。

1.1.3 仪器与试剂 X-5数字显示显微熔点仪(北京泰克仪器有限公司，温度未校正；Q-Tof MicroTM 高分辨质谱仪；TENSOR 27傅立叶红外光谱仪(德国Bruker)；BRUCKER 300M核磁共振仪(德国，TMS为内标)；CL-2型恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)。

2%宁南霉素(广州穗泽环保科技有限公司)；三唑酮(江苏农禾农业科技有限公司)；氨基硫脲，CS2,1-氯丁烷，1-溴己烷(上海诺泰化工有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙腈(上海海曲化工有限公司)；所用试剂均为市售分析纯或化学纯。

1.2试验方法

目标化合物N-(4-三氟甲基)苯基-N′-[5-S-烃基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲的合成路线见图1。

2-氨基-5-S-烃基-1,3,4-噻二唑衍生物参看文献[18]合成。

在50 mL圆底烧瓶中加入0.2 g(1.0 mmol)三氟甲基异硫氰酸苯酯，用1.5 mL DMF溶解后，再加入0.28 g(1.3 mmol)1,3,4-噻二唑衍生物和1.5 mL乙腈,加热回流10 h后停止反应(用TLC跟踪)。反应后，加水冷却，有固体析出，用DMF和无水乙醇混合液重结晶(图1)。

图1 目标化合物的合成路线Fig.1 Synthetic route of target compounds

新合成化合物的物理特性及结构特征如下:

N-(4-三氟甲基)苯基-N′-[5-S-正丁基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲 (4a):白色固体粉末,产率 78.5%,m.p.187.5～188.8 ℃.IR cm-1:3207 (N-H),1331 (C═S),1538,1490,1400,1255,1047,850 (噻二唑环),657 (C-S-C);1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:0.91 (t,J = 8.0 Hz,3H,CH3),1.38～1.47 (m,2H,CH2),1.65～1.72 (m,2H,CH2),3.23 (t,J = 8.0 Hz,2H,SCH2),7.67 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),7.96 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),10.82 (s,H,NH),14.59 (br,1H,NH)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:13.37 (CH3),21.11 (CH2),30.96 (CH2),32.88 (SCH2),121.61 (CF3),124.38 (CH),126.57 (CH),128.61 (C-CF3),138.96 (C-N),155.82,160.31 (噻二唑环,C2,C5),181.57 (C═S); HRMS(ESI):C14H15F3N4S3m/z [M+H]+calcd.393.0489,found 393.0485.N-(4-三氟甲基)苯基)-N′-[5-S-正己基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲 (4b):黄色固体粉末,产率 72.4%,m.p.：222.5～223.7 ℃.IR cm-1:3328 (N-H),1330 (C═S),1538,1491,1398,1256,1068,843 (噻二唑环),658 (C-S-C);1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ：0.87 (t,J = 8.0 Hz,3H,CH3),1.28～1.42 (m,6H,CH2),1.66～1.73 (m,2H,CH2),3.22(t,J = 8.0 Hz,2H,SCH2),7.66 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),7.96 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),10.81 (s,H,NH),14.65 (br.,1H,NH) ;13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:13.82 (CH3),21.92 (CH2),27.56 (CH2),28.84 (CH2),30.61 (CH2),32.79 (SCH2),121.73 (CF3),123.02 (CH),125.54 (CH),125.72 (C-CF3),143.15 (C-N),154.37,162.51 (噻二唑环,C2,C5),181.57 (C═S); HRMS(ESI):C16H19F3N4S3m/z [M+H]+:calcd.421.0802,found 421.0796.

1.3毒力测定

根据二倍稀释法，将供试药品设定为200，100，50，25，12.5 mg·L-15个质量浓度，药品的制备在无菌条件下进行；以新月弯孢菌(Curvularialunata)、棉花枯萎病菌(CottonfusariumWilt)、烟草黑胫菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)为研究对象。按照生长速率法[19]，将一定质量浓度的药品分别取3.0 mL加入到灭菌后的含27.0 mL PDA培养基的锥形瓶中，摇匀后倒入3个直径90 mm的培养皿中，即设定3个重复，待其冷却凝固；同时用不含药品的培养基做对照。在已经生长好的待测菌种上取直径6.5 mm的菌饼放到培养皿中央位置，在(28±1)℃培养箱中培养5 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。然后以抑制率对应的概率值为y，相对应的化合物质量浓度的对数值为x，通过SPSS 19做线性回归，建立毒力回归方程y=ax+b，并计算相关系数r和有效抑制中浓度EC50。

1.4烟草花叶病防治试验

在25 ℃防虫温室内，采取盆栽形式，以枯斑寄主半叶法[20]，选取长势一致的珊西烟为对象进行药剂生物活性测定试验。

1.4.1 预防试验 移栽后，挑选长势一致，具有6～7片真叶的珊西烟，对其进行喷药处理，24 h后，用常规汁液摩擦法接种TMV病毒液，以清水处理作为对照组，每个处理设置3次重复，观察发病情况，及时记录发病枯斑数，计算枯斑抑制率。

1.4.2 治疗试验 移栽后，挑选长势一致，具有6～7片真叶的珊西烟，采用常规汁液接种法接种TMV病毒液，12 h后，对各处理喷药，以接种后喷施清水的处理作为对照组，每个处理设置3次重复，观察发病状况，及时记录发病枯斑数，计算枯斑抑制率。

2 结果与分析

2.1目标化合物合成条件的筛选

由于反应物质在不同的溶剂条件下，达到的沸点不同，且产物的得率与沸腾后的回流时间有关，因此，选用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、乙醇及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈等比例混合溶剂进行筛选合成溶剂。结果显示，选用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)做溶剂，沸点高，回流状态下副产物多，且产物在DMF溶解度大，不易析出；选用乙腈或乙醇，虽然沸点低，但基本没有产物生成；选用DMF和乙腈等比例混合溶剂，反应温度控制在回流状态下能获得高产率产品。采用薄板层析 [GF254硅胶板，V(乙酸乙酯)∶V(石油醚，60～90 ℃)=1∶3]跟踪反应结果显示(表1)，回流10 h，反应原料已基本消失，收率达78.52%；大于10 h，产率没有明显提高。

表1 不同反应溶剂对目标化合物产率的影响Table 1 The effect of various solvent on productivity

2.2目标产物4a,4b分子结构的波谱解析

采用红外光谱(IR)检测产物 N-H的强伸缩振动出现在3 207～3 341 cm-1，C═S的强伸缩振动峰出现在1 330～1 331 cm-1，1 538～843 cm-1是1,3,4-噻二唑环的振动吸收，C-S-C的振动吸收在657～658 cm-1处(图2)；碳核磁共振波谱(13C-NMR)检测C═S中的碳信号峰出现在181.57，1,3,4-噻二唑环上的C2,C5分别在154.37～155.82和160.31～162.51范围内，-CF3中的碳出现在121.61～121.73(图3)，这些数据表明产物的分子表征符合设计的4a和4b分子结构特征。(由图1可知,4a和4b除了R基团C原子数目不同外，结构是一致的，因此，4b的光谱数据与4a相比，仅会有一些小的吸收峰不同，但不影响主要分子表征应产生的峰值)。高分辨质谱(HRMS(ESI) 中的m/z [M+H]+)检验相对分子质量结果显示，4a和4b的相对分子质量分别为393.0485和421.0796(图4、图5)与该物质相对分子质量的计算值基本相等。这些特征说明新合成化合物的波谱数据与分子结构完全吻合。

图2 目标产物4a的红外光谱图Fig.2 The infrared spectra of compound 4a

图3 目标产物4a 的碳核磁共振谱图Fig.3 The 13C-NMR spectra of compound 4a

图4 目标产物4a的高分辨质谱图Fig.4 The HRMS spectra of compound 4a

图5 目标产物4b的高分辨质谱图Fig.5 The HRMS of compound 4b

2.3目标产物4a,4b对植物病原真菌的毒力测定

目前，三唑酮是广泛应用的抗真菌的有效药物，因此,本试验以三唑酮为对照检验4a和4b的抗真菌效果，结果显示(表2)，在抗新月弯孢菌方面4a和4b的效果明显强于三唑酮，尤其是4a提高9.78%；在抗棉花枯萎病菌方面，4a效果明显强于三唑酮，提高9.04%；在抗烟草黑胫菌方面，4b的效果明显强于三唑酮，提高15.52%；在抗禾谷镰孢菌方面，4b效果明显强于三唑酮，提高8.41%；从抑制率达到50%使用药物质量浓度EC50(mg·L-1)可以看出，4a和4b在抗新月弯孢菌、棉枯萎镰刀菌和烟草黑胫菌方面，具有明显优势，尤其是4b在抗新月弯孢菌和烟草黑胫菌方面，4a在抗棉枯萎镰刀菌方面都呈现药物用量明显小于三唑酮。

表2 目标产物4a，4b对4种植物病原菌的毒力测定Table 2 Inhibition effect of compound 4a,4b against four kinds of plant fungicidal

2.4目标产物4a,4b对烟草花叶病(TMV)的防治效果分析

以珊西烟为试验材料，采取半叶枯斑法对接种TMV前后分别喷4a和4b进行防治,结果试验显示(表3)，4a，4b对烟草花叶病的治疗效果并不明显，但4b比2%宁南霉素预防效果提高25.44%。

表3 目标产物4a，4b在珊西烟上对TMV的防治效果Table 3 The control effect of compound 4a,4b to TMV on Xanthi-NN

3 小结与讨论

本研究描述了由初始原料氨基硫脲通过环化，烷基化，得中间产物5-S-烃基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基异硫氰酸苯酯作用合成目标产物4a,4b的方法，并对产物的结构进行了表征。OTELEANU等[21]曾合成5个N-苯基-N′-(5-S-烃基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫脲类化合物，但对其生物活性没有进行测定；MAHAJAN等[22]合成了N-(7-氯喹啉-4-基)-N′-(5-S-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫脲，只对其抗疟疾及抗癌活性进行了测定。这二者合成都采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，产率低，后处理麻烦。本研究对新化合物的合成方法进行改进，后处理简单，提高了产率，并对化合物的抗菌性及抗烟草花叶病毒(TMV)的活性进行了测定。初步生物活性测试结果显示,化合物4a和4b对4种真菌有不同程度的抑制作用，其中化合物4a对新月弯孢菌，棉枯萎镰刀菌的抑菌效果好于三唑酮，而4b新月弯孢菌，抗棉枯萎镰刀菌及烟草黑胫菌的抑菌效果好于三唑酮。化合物4a和4b对TMV的治疗抑制率略高于或接近宁南霉素，预防抑制率高于宁南霉素，尤其是化合物4b的预防抑制率达70%～80%，这和宋宝安等[23]合成的硫脲类物质研究结果基本相同，但是高于XU等[24]用硫醚修饰的1,3,4-噻二唑化合物对TMV的预防效果。但该类化合物的溶解性能有待进一步改进。

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(责任编辑：常思敏)

Synthesisandantifungalandanti-TMVactivitiesofnovelthioureascontaining1,3,4-thiadiazole

SONG Hailong1,ZHAO Yuze3,WANG Caixia1,2,ZHOU Qi3,LIU Weiqun1,3

(1.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to get compounds which have high-powered anti-microbial pathogens,two new N-heterocyclic thiourea compounds were synthesized by 1,3,4-thiadiazole derivatives and trifluoromethyl phenyl isothiocyanate.The chemical structure and molecular weight was confirmed by IR,1H-NMR,13C-NMR and HRMS.The antibacterial test showed that:compound 4a and 4b exhibited better antifungal activities at the concentration of 200 mg·L-1and 100 mg·L-1against Curvularia lunata,Cotton Fusarium,Wilt,Phytophthora parasitica var nicotianae and Fusarium graminearum compared with triadimefon.In the prevention and treatment of tobatco mosaic virus (TMV),the inhibition rate of compound 4b reached 78.38% at the concentration of 500 mg·L-1,increasing by 25.44% compared with ningnanmycin,and 4b showed a good preventive effect against TMV.

thiourea derivatives; tobacco; synthesize; biological activity

S 572

：A

2015-01-05

河南省教育厅科学技术基础研究重点项目(30600808)

宋海龙(1989-)，男，河南郑州人，硕士研究生，主要从事烟草生理和化学研究。

刘卫群(1956-)，女，河北临城人，教授，博士生导师。

1000-2340(2016)03-0370-06