VGEFR2在哈萨克族食管鳞癌中的表达及临床病理参数分析

汪　慧， 冯志寅， 陈　晓

(新疆医科大学基础医学院病理学教研室， 乌鲁木齐　830011)



·民族肿瘤学·

VGEFR2在哈萨克族食管鳞癌中的表达及临床病理参数分析

汪慧， 冯志寅， 陈晓

(新疆医科大学基础医学院病理学教研室， 乌鲁木齐830011)

目的探讨在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2 )的表达及其临床意义。方法采用Western blot方法对14例食管鳞状细胞癌组织及相应癌旁正常组织中VEGFR2蛋白的表达情况进行分析，验证其表达的差异情况。采用免疫组织化学(SP法)检测在162例石蜡包埋食管鳞状细胞癌组织及50例癌旁正常组织中VGEFR2的表达情况,分析其与临床病理参数的关系。结果Western blot结果显示VEGFR2在食管鳞状细胞癌组织中的表达高于相应癌旁正常组织(F=16.413，P<0.001)；免疫组化结果显示VEGFR2在食管癌组织中的阳性表达率(66.0%)高于癌旁正常组织(46.0%)(χ2=6.475，P=0.013)，并且T分期(χ2=8.682，P=0.034)、淋巴结是否转移(χ2=7.227，P=0.008)与VGEFR2在食管鳞状细胞癌组织中阳性表达有关。结论VEGFR2在食管鳞状细胞癌组织中显著性高表达，其对食管鳞癌的发生发展、恶化及转移有一定影响，对VEGFR2的检测在食管鳞癌的早期临床诊断及治疗中的抗转移有重要价值。

食管鳞状细胞癌； 血管内皮细胞生长因子受体2(VGEFR2)； 哈萨克族； Western blot； 免疫组织化学

食管癌(esophageal cancer ,EC)是世界上常见、高发的消化系统恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第6位、死因的第5位[1]。 在我国，食管癌的发病类型95%为鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC )，其5年生存率<10%[2]。新疆是我国食管癌的高发区，其中哈萨克族是食管癌的高发民族，其食管癌死亡率达155.9/10万，高于我国平均水平的15.23/10万，是本地区重点防治的恶性肿瘤[3]。本课题组前期研究在食管鳞状细胞癌组织中筛选出多组差异蛋白，其中血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)在ESCC和食管正常组织的表达存在差异。VEGFR2又名激酶插入区受体(kinase domain recrptor，KDR),编码基因位点在4q12，是由1 356个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，当其为成熟糖基化形式时可实现细胞信号转导。Gockel等[4]研究受体酪氨酸激酶(RTK)在食管鳞癌与食管腺癌的共表达模式也证实VEGFR2在食管鳞癌细胞系中过表达。本研究采用Western blot技术及免疫组织化学方法，观察VEGFR2在哈萨克族食管鳞癌组织中的表达，并结合临床病理参数进行分析，探讨VEGFR2与哈萨克族食管鳞癌的关系，为临床早期诊断、制定个体化治疗方案及预后判定提供理论依据。

1　材料与方法

1.1临床标本收集2014年1月-2015年8月于新疆医科大学第一附属医院行食管癌根治术后的食管鳞状细胞癌患者新鲜癌组织及距相应病灶5 cm外正常组织(癌旁正常组织)标本共14对。新疆医科大学第一附属医院组织病理库中2010年3月-2015年8月食管鳞状细胞癌石蜡包埋癌组织162例及癌旁正常组织50例。162例石蜡包埋组织中，患者年龄50～75岁，平均(63.46±9.01)岁；男性108例，女性54例；汉族95例，哈萨克族67例；淋巴结转移107例，未转移55例。选取标本均由病理结果证实为鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织，本研究已通过医院伦理委员会伦审(伦审号:20130216-160)，患者术前均签署知情同意书。

1.2试剂一抗Rabbit Anti-VEGFR2 antibody (bs-10412R) 购于北京博奥森生物技术有限公司，二抗Goat Anti-Rabbit IgG/AP购于康为世纪生物公司，过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase，SP)检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1Western blot方法提取新鲜组织蛋白样品，用BCA法对蛋白浓度进行测定。100℃加热使蛋白变性，取蛋白样品上样于10%的SDS-PAGE凝胶中电泳50 min，于冰上转至PVDF膜，清洗印迹膜，用5%脱脂奶粉封闭 2 h。加入稀释至适当浓度的特异性一抗( 1∶500)，4℃摇床过夜，TBST洗膜10 min×3次， 加入用TBST稀释后的二抗(1∶8 000稀释)，室温避光孵育2 h，TBST洗膜10 min×4次。于暗室内用 BCIP/NBT显色液显色5～10 min， 出现蛋白条带后停止显色，于凝胶成像仪中拍照记录，分析条带灰度值, 以 β-actin 为内参。

1.3.2免疫组织化学方法及结果判定收集的石蜡标本由病理科专业技师进行连续切片，每张切片厚度约为4 μm，每个标本均选取1张切片以PBS代替一抗设立空白对照。采用免疫组化(SP)法观察VEGFR2的表达情况，一抗浓度为1∶100。用免疫组化图像采集系统收集图像数据。每张片子随机选取5个高倍镜视野(×400)，将视野中阳性细胞所占比例(A)分为≤1%、2%～25%、26%～50%、≥50%4个分段，评分分别为0、1、2、3分。染色强度(B)分为无色、淡黄色、浅棕色、深棕色，评分分别为0、1、2、3分。最后根据A×B的得分为最终评分，判断染色结果，最终评分≥3即为阳性表达，<4即为阴性表达。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析对Western Blot的灰度进行统计；在临床病理参数分析中计量资料和计数资料分别采用独立样本t检验和Pearson卡方检验，计数资料若频数≤5则采用Fisher确切概率法，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1 VEGFR2的蛋白表达结果VEGFR2的表达在哈萨克族食管鳞状细胞癌肿瘤组织中较相应癌旁正常组织高，差异有统计学意义(F=16.413，P=0.002<0.05)；VEGFR2的表达在汉族食管鳞状细胞癌肿瘤组织中较相应癌旁正常组织高，差异有统计学意义(F=9.656，P=0.011<0.05)，见图1。虽然哈萨克族食管癌肿瘤组织中VEGFR2的表达高于汉族食管癌肿瘤组织，但表达差异无统计学意义(F=1.815，P=0.208>0.05)，见图2。

注: K-T： 哈萨克族食管鳞状细胞癌组织; H-T：汉族食管鳞状细胞癌组织; K-N：哈萨克族相应癌旁正常组织; H-N：汉族相应癌旁正常组织; β-Actin： 内参

图1VEGFR2蛋白表达的Western Blot结果

2.2VEGFR2的免疫组化结果在食管鳞状细胞癌中VEGFR2表现为胞浆中满布棕黄色颗粒，胞膜染色较强，细胞轮廓可见，阳性免疫反应主要见于细胞膜和细胞浆； VEGFR2在癌旁正常组织中可见少量胞浆表达，染色强度较低，强弱不等，阳性细胞所占比例较小，且未见鳞状上皮细胞着色，根据评分标准可判为阴性表达，见图3。 在162例食管鳞癌组织中，55例VEGFR2表达阴性，107例表达阳性；在50例癌旁正常组织中，27例表达阴性，23例表达阳性，可以认为VEGFR2在食管鳞癌组织中的阳性表达率(66.0%)高于癌旁正常组织(46.0%)，差异有统计学意义(χ2=6.475，P=0.013<0.05)。

a： VEGFR2在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达

b： VEGFR2在癌旁正常组织中的阴性表达

图3VEGFR2的免疫组化结果(×400)

2.3食管鳞状细胞癌VEGFR2临床病理参数分析在162例食管鳞状细胞癌临床病理资料中，VEGFR2在食管鳞状细胞癌组织的表达与患者年龄(t=-0.407，P=0.685)、性别(χ2=3.978，P=0.054)、族别(χ2=0.346，P=0.615)、肿瘤部位(χ2=5.682，P=0.058)、病理分型(χ2=7.199，P=0.066)、分化程度(χ2=0.756，P=0.441)、肿瘤最大径(t=-0.303，P=0.762)无关(P>0.05)；而T分期(χ2=8.682，P=0.034)、淋巴结是否转移(χ2=7.227，P=0.008)与VEGFR2在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达相关(P<0.05)，见表1。

表1　食管鳞状细胞癌VEGFR2临床病理参数分析/例(%)

3　讨论

血管形成的调节需要多种信号分子的共同参与,VEGFR 2作为内皮细胞分裂、生存以及微血管通透性调节的主要介导者，与VEGF一起在生理及病理状态血管形成过程中发挥了关键性作用[5]。Ferrara 等[6]认为新形成的肿瘤血管可以为肿瘤提供营养和氧气供其增长，并可作为肿瘤的传播渠道脱离原发肿瘤，考虑到VEGFR在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，而肿瘤血管生成在肿瘤形成的发展过程中起着至关重要的作用,因此在癌症的分子靶向治疗中，抗血管生成药物的发展已经成为当前的趋势[7]。 如抑制血管内皮生长因子VEGFR生成的贝伐单抗[8-11]、选择性的第二代VEGFR抑制剂阿西替尼[12-13]、VEGFR2激酶抑制剂喹唑啉衍生物的化合物(11 d)[14]等，但VEGFR2在食管鳞癌方面的研究较少。

本研究中Western blot实验结果显示，不论哈萨克族还是汉族，其食管鳞状细胞癌肿瘤组织均高于相应癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。这与Xu等[15]的研究结果一致，可以考虑从VEGFR2的信号通路入手，探讨食管癌的靶向治疗方向。此外，VEGFR2的表达在哈萨克族食管癌肿瘤组织和汉族食管癌肿瘤组织的差异没有统计学意义(P>0.05)，尚不能用于族群间的诊断。由于VEGFR2在哈萨克族食管鳞癌组织中的表达尚无明确报道，暂无法进行对比验证，考虑到本研究样本例数有限，以及随着民族聚居，各民族的生活饮食习惯差距逐渐减小，造成肿瘤疾病的民族差异降低等因素的影响，可能导致实验结果偏倚，因此尚需进一步研究证实。但可以肯定的是VEGFR2在肿瘤细胞中呈高表达。这点与Qin等[16]的研究结果一致。

免疫组化结果显示VEGFR2在食管鳞癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织，这与Western blot结果一致，结合临床参数分析得出VEGFR2在食管鳞状细胞癌肿瘤组织是否阳性表达与患者年龄、性别、族别、肿瘤部位、病理分型、分化程度、肿瘤最大径无关，而与T分期、淋巴结是否转移有关，这与Yakes等[17]的研究结果不完全一致，考虑为本研究选取的标本为近5 a的石蜡标本，蜡块存放时间相对较长，尚不能完全反映食管鳞状细胞癌分子生物学的全部信息所致，具体尚需收集近期石蜡标本并扩大样本量以进一步验证。另免疫组织化学的评分标准因人而异，这也可能是造成与他人研究结果不一致的原因。

综上所述，VEGFR2在食管鳞癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织，且其与食管癌淋巴结的分期和转移存在相关性。众所周知，食管鳞状细胞癌(ESCC)很容易侵入邻近组织和转移淋巴结[18-19]，但本研究结果尚不足以证实其有明确相关性，此结果有待进一步验证。关于食管鳞癌中VEGFR2的研究相对较少，但Kampmann 等[20]在对软组织肉瘤的研究中发现，VEGFR2高表达预示患者远期生存率降低，但考虑到不同组织、不同民族存在的遗传背景差异，尚需更多研究支持本结论。本次实验通过对哈萨克族食管癌与汉族食管癌中的VEGFR2进行分析，为食管鳞癌的早期诊断、治疗中抗转移及靶基因治疗等方面提供了理论依据。

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(本文编辑杨晨晨)

Expression and significance of VEGFR2 in esophageal squamous cell carcinoma of Kazaks

WANG Hui, FENG Zhiyin, CHEN Xiao

(DepartmentofPathology,CollegeofBasicMedicine,XingjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of VGEFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC ) of Kazak. MethodsWestern blot technology was used to analyze the expression of VEGFR2 protein in 14 cases of esophageal squamous cell carcinoma and corresponding normal tissues, and verify the difference of its expression. Then immunohistochemistry (SP) method was used to detect the expression of VGEFR2 in 162 cases of paraffin-embedded esophageal squamous cell carcinoma and 50 cases of normal esophageal tissue and analyze its relationship with clinicopathological parameters. Cox regression was used to analysis its links with esophageal squamous cell carcinoma prognosis. ResultsWestern blot showed that the expression of VEGFR2 in esophageal squamous cell carcinoma was higher than the corresponding adjacent normal tissues (F=16.413, P<0.001); Iimmunohistochemical results suggest that the positive expression rate of VEGFR2 in esophageal carcinoma (66.0%) was higher than that in the normal esophageal mucosa (46.0%) (χ2=6.475, P=0.013. There ws a correlation between the positive expression of VGEFR2 in esophageal squamous cell carcinoma tumor tissue and T stage (χ2=8.682, P=0.034) and whether lymph node metastasis (χ2=7.227, P=0.008). ConclusionCompare to corresponding normal tissues, VEGFR2 had obvious expression in esophageal squamous cell carcinoma, which had an impact on the deterioration , metastasis and survival of esophageal squamous cell carcinoma. So the detection of VEGFR2 has significant value in the early diagnosis and anti-metastasis during treatment of esophageal squamous cell carcinoma.

esophageal squamous cell carcinoma; vascular endothelial growth factor receptor 2; Kazak; western blot; immunohistochemistry (SP)

国家自然科学基金(81360303)

汪慧(1991-)，女，在读硕士，研究方向：食管癌蛋白质组学研究。

陈晓，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：食管癌蛋白质组学研究，E-mail：xjchenxiao@sina．com。

R735.1

A

1009-5551(2016)09-1197-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.030

2016-06-28]