共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在骨性关节炎滑膜组织中的表达及其临床意义研究

赵　芳, 邓　玮, 丁剑冰

(新疆医科大学1第六附属医院检验科， 2第六附属医院医院办公室, 乌鲁木齐　830002, 3基础医学院免疫学教研室， 乌鲁木齐　830011)



共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在骨性关节炎滑膜组织中的表达及其临床意义研究

赵芳1, 邓玮2, 丁剑冰3

(新疆医科大学1第六附属医院检验科，2第六附属医院医院办公室, 乌鲁木齐830002,3基础医学院免疫学教研室， 乌鲁木齐830011)

目的研究共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在膝关节骨性关节炎(OA)滑膜组织中的表达及其临床意义。方法分别采集14例OA轻度及18例OA重度患者滑膜病变部位和远离病变部位，经HE染色法观察其病理改变，免疫组织化学法检测滑膜组织中ICOS、ICOSL的表达情况。结果OA轻度患病组和重度患病组滑膜组织病变部位出现明显的炎性改变。ICOS、ICOSL在OA患者病变滑膜组织中高表达，且重度患病组表达最高。结论ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病变滑膜组织中高表达，对炎症反应的免疫紊乱和免疫损伤发挥重要作用。

诱导共刺激分子(ICOS); 诱导共刺激分子特异性配体(ICOSL)； 骨性关节炎(OA)

骨性关节炎(Osteroarthritis，OA)是目前较为常见的骨性关节疾病，尤其严重影响老年人的生活质量。近年研究发现，OA患者的免疫细胞和免疫介质出现异常现象[1]。根据可诱导共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)活化后诱导和调节免疫反应的特性,推断ICOS/ICOSL信号可能在OA的发生、发展过程中发挥作用，从而参与OA的免疫损伤和免疫紊乱的调节[2]。因此，对ICOS、ICOSL共刺激通路的调控有望为多种疾病开辟新的免疫方法学治疗的途径。本研究通过使用免疫组织化学法检测ICOS、ICOSL的表达，以探讨OA的发病过程与正性共刺激分子是否存在关系，为研究共刺激分子在OA的免疫学发病机制中可能的作用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1一般资料选择2015年9月-2015年11月在新疆医科大学第六附属医院关节镜外科、骨病矫形科、关节外科、创伤骨科住院的OA患者共32例，OA的诊断根据《膝关节骨性关节炎诊疗规范》(2008版)[3]中的标准进行,患者年龄>38岁，无创伤性骨折、类风湿性关节炎(RA)、骨肿瘤、结核、化脓及关节内骨折急性期，其中男性10例，女性22例，平均年龄(60.63±8.62)岁。

1.2仪器与试剂显微镜(Leica DM3000)，切片机(Leica RM2135)，Motic Bs显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司),兔抗ICOS免疫组化一抗(浓度为1∶150,abcam公司)，兔抗ICOSL免疫组化一抗(浓度为1∶200,北京博奥森有限公司)，免疫组化检测试剂二抗(北京奥博来科技有限责任公司)。

1.3滑膜组织的采集按Kellgren-Lawrence分期，将Ⅰ级、Ⅱ级患者设为轻度患病组(14例)，Ⅲ级、Ⅳ级设为重度患病组(18例)。分别收集两组患者行关节手术后的膝关节滑膜组织的病变部位和远离病变部位(病变与正常组织交界远离病变部位2 cm处)，病变大小为5 mm×3 mm。置于10%中性甲醛液固定24 h，取出石蜡包埋切片，用于病理学观察和免疫组织化学检测。

1.4HE染色观察将轻度、重度患病组滑膜组织病变部位和远离病变部位制作的切片进行HE染色，在显微镜下观察其病理情况。

1.5免疫组化法观察关节滑膜组织中ICOS/ICOSL的表达情况每张滑膜组织切片随机选取5个不同视野分别采集图像(100倍)，采用IPP专业图像分析软件得出分布面积(area)、光密度(OD)及累积光密度值(IOD)，进行统计学分析。实验中设置阳性对照和阴性对照。以试剂公司提供的阳性片染色后作为阳性质控，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。

2　结果

2.1骨性关节炎膝关节滑膜组织的病理改变轻度患病组和重度患病组的远离病变部位滑膜组织结构正常，可见细胞排列有序，由1～3层滑膜细胞组成，滑膜下层细胞数量较少。滑膜内少见淋巴细胞和浆细胞(图1)。

a： 远离病变部位滑膜组织b：病变滑膜组织

图1骨性关节炎的病理形态学检测(HE×100倍)

2.2轻度患病组和重度患病组滑膜组织不同分级的病理改变轻度患病组病变部位的滑膜经HE染色后，可见滑膜组织疏松、细胞水肿，除了淋巴细胞和浆细胞外，滑膜内见少量嗜中性粒细胞增生和单核细胞浸润。重度患病组病变部位的滑膜经HE染色后，可见细胞水肿、滑膜组织疏松，除了淋巴细胞和浆细胞外，滑膜内大量单核细胞和嗜中性粒细胞增生，滑膜细胞的数量增多，见疏松结缔组织。出现一些绒毛滑膜增生和纤维素渗出，可见大量血管增生,并且血管周围有淋巴细胞和纤维增生包裹。滑膜表面形成瘢痕(图2)。

a： Ⅰ级

c： Ⅲ级

c： Ⅲ级

d： Ⅳ级

图2膝关节滑膜组织按K-L分期的病理改变(HE×100倍)

2.3OA患者滑膜组织中ICOS、ICOSL的表达和分布免疫组织化学分析结果显示，滑膜组织中ICOS阳性表达主要位于细胞浆。OA患者滑膜组织可见 ICOS分子的表达，而远离病变部位的轻度患病组和重度患病组，未见ICOS、ICOSL阳性表达(图3、4)。轻度患病组、重度患病组的病变滑膜组织中ICOS、ICOSL表达的IOD值高于远离病变滑膜组织，差异有统计学意义(P<0.05),并且重度患病组病变滑膜组织中ICOS、ICOSL表达的IOD升高更为显著，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

a： 远离病变部位滑膜组织ICOS表达

b： 远离病变部位滑膜组织ICOSL表达

c： 病变滑膜组织ICOS表达

d ：病变滑膜组织ICOSL表达

图3轻度患病组滑膜组织ICOS/ICOSL的免疫组化表达情况(×100倍)

a： 远离病变部位滑膜组织ICOS表达

b： 远离病变部位滑膜组织ICOSL表达

c： 病变滑膜组织ICOS表达

d ：病变滑膜组织ICOSL表达

图4　重度患病组滑膜组织ICOS/ICOSL的免疫组化表达情况(×100倍)

注：与远离病变部位滑膜组织比较，*P<0.05; 与轻度患病组比较，△P<0.05。

3　讨论

关于ICOS在OA的发病中的作用少有报道。张卫东等[4]对近10年文献数据进行分析，OA与类风湿性关节炎之间存在很大的相关性。Smith等[5]运用免疫组织化学方法和传统的组织学染色研究骨性关节炎的滑膜组织学变化。王婷等[6]采用流式细胞术和RT-PCR的方法检测患者外周血淋巴细胞表面共刺激分子ICOS和ICOSL的表达,发现其与类风湿性关节炎具有相似性。本研究显示，OA患者的滑膜组织中均可见ICOS 和 ICOSL 出现阳性高表达，提示ICOS和ICOSL分子可能也参与了骨性关节炎的局部炎症反应。

早期的研究表明ICOS、ICOSL信号通路可促进Th1和Th2相关细胞因子的释放，通过研究类风湿性关节炎， Grave′s 病、重症肌无力和狼疮性肾炎等自身免疫病发现，ICOS、ICOSL 共刺激通路主要在 T 细胞应答的效应阶段发挥作用。ICOS、ICOSL共刺激通路的调控与自身免疫病的发病机制和进程关系密切[7]。机体免疫系统在正常生理情况下，具有识别“自我”的能力，因而对自身的组织细胞成分不会产生免疫应答，或者产生免疫应答及其微弱，但是如出现某些病理情况，机体的自身的免疫耐受遭到破坏，致使机体的免疫系统对自己的组织细胞成分视为“异己 ”，从而产生免疫应答反应[8]。本研究发现，在OA患者的滑膜组织中可见ICOS 和 ICOSL 的阳性表达，明显高于远离病变部位，并且根据OA患病的程度而发生变化，因此ICOS 和 ICOSL可能在骨性关节炎的免疫紊乱机制中起着介导炎症反应发生的作用。共刺激分子ICOS、ICOSL在OA患者滑膜组织中表达呈阳性，考虑可能是ICOS 和 ICOSL 信号通路过度诱导引起T 淋巴细胞的活化 ，从而导致了慢性炎症反应的免疫紊乱和免疫损伤。

本研究中，ICOS、ICOSL在远离病变滑膜组织中不表达，但是在骨性关节炎患者的滑膜组织中出现阳性表达，并且重度患病组的表达更强，提示ICOS、ICOSL阳性表达情况与骨性关节炎的疾病发生程度存在关系，其发生的机制有待进一步研究。

共刺激信号的分子结构明显不同，ICOS 和 ICOSL 主要在免疫效应阶段发挥正性共刺激信号分子的作用。本研究采用免疫组织化学检测技术观察共刺激分子ICOS、ICOSL 在OA患者滑膜组织中的表达情况，研究结果显示ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病变滑膜组织中高表达，对炎症反应的免疫紊乱和免疫损伤发挥重要作用，为骨性关节炎的治疗寻找可能的新靶点。

[1]宋维亚，厉小梅，李向培.T细胞在骨性关节炎发病机制中的作用[J].安徽医药，2010，14(4):476-478.

[2]李盛村，王婷，王国祥.ICOS/ICOSL的免疫调节作用与相关疾病的研究进展[J].基础医学与临床，2014,34(10)：1434-1437.

[3]王秀义，王文强，王文军，等.膝关节骨性关节炎(KOA)诊疗规范[C]//中华中医药学会针刀医学分会二〇〇八年度学术会议.2008.

[4]张卫东,戴刚,杨柳,等.近10年滑膜相关疾病研究的文献计量学分析[J].重庆医学, 2006, 35(4):316-321.

[5]Smith SC, Folefac VA, Revell PA, et al. An immunocytochemical study of the distribution of proline-4-hydroxylase in normal, osteoarthritic and rheumatoid arthritic synovium at both the light and electron microscopic level[J].Br J Rheumatol,1998,37(3):287-291.

[6]王婷,蒋觉安,胡筱涵,等.ICOS/ICOSL在类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的表达及临床意义[J].中国免疫学杂志,2015，31(3)：369-374.

[7]王青松,厉小梅.阻断ICOS/ICOSL途径用于治疗自身免疫性疾病的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,7(31):985-988.

[8]李盛村,王婷,王国祥.ICOS/ICOSL的免疫调节作用与相关疾病的研究进展[J].基础医学与临床,2014,34(10):1434-1437.

(本文编辑杨晨晨)

Research on the expression of ICOS, ICOSL stimulus molecule in the Osteroarthritis synovial tissue with its clinical significance

ZHAO Fang1, DENG Wei2, DING Jianbing3

(1DepartmentofLaboratory,2HospitalOffice,TheSixthAffiliatedHospital,Urumqi830002,China;3DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo research on the expression of ICOS, ICOSL stimulus molecule in the synovial tissue of osteroarthritis (OA) patientsand its clinical significance. MethodsSynovial tissue lesions and distant sites of 14 cases of mild illness groups and 18 cases of severe illness group were collected to take HE staining. Immunohistochemistry were used to detect the expression of ICOS, ICOSL. ResultsOA synovial tissue of patients had pathological changes. ICOS, ICOSL were highly expressed in OA patients, and severe illness group had the highest expression level with the change of the disease varies. ConclusionThe level of ICOS，ICOSL significantly increased in OA synovial tissue of patients might be due tochronic inflammation immune disorders and immune injury. Keywords: induced by stimulating molecules (ICOS); inducible co stimulator ligand (ICOSL); osteoarthritis

新疆医科大学科研创新基金(XJC2013223)

赵芳(1981-)，女，硕士，主管检验师，研究方向：自身免疫学。

丁剑冰，女，教授，博士生导师，研究方向：免疫学，E-mail：331044524@qq.com。

R684.3

A

1009-5551(2016)09-1128-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.012

2016-05-12]