维生素D受体SNPs基因多态性与新疆汉族2型糖尿病视网膜病变相关性研究

李　丽， 易湘龙， 钱　一， 周　维， 赵春焕， 梅　波

(新疆医科大学1第五附属医院眼科， 乌鲁木齐　830011; 2第一附属医院眼科， 乌鲁木齐　830054)



维生素D受体SNPs基因多态性与新疆汉族2型糖尿病视网膜病变相关性研究

李丽1， 易湘龙2， 钱一2， 周维2， 赵春焕2， 梅波2

(新疆医科大学1第五附属医院眼科， 乌鲁木齐830011;2第一附属医院眼科， 乌鲁木齐830054)

目的探讨维生素D受体(VDR)BsmⅠ、 ApaⅠ、 FokⅠ 、TaqⅠ基因多态性与新疆汉族2型糖尿病视网膜病变的关系。方法589例新疆汉族T2DM患者入选，其中非增殖性糖尿病视网膜病变患者181例，增殖性糖尿病视网膜病变患者146例，无糖尿病视网膜病变患者262例。抽取血液样本提取DNA。采用iMLDR技术进行VDR基因BsmⅠ、 ApaⅠ、 FokⅠ 、TaqⅠ位点基因分型，计算等位基因及基因型并进行χ2检验 。结果3组rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236基因型及等位基因分布频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4个SNPs的多态性与新疆汉族2型糖尿病视网膜病变无关。

糖尿病视网膜病变； 维生素D受体； 基因多态性

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的微血管并发症和致盲性眼病之一。DR的发病机制尚未阐明。近年来，有关DR基因多态性的研究不断深入，而维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)基因多态性与DR的相关性逐渐成为研究热点[1-3]。本研究通过iMLDR技术进行SNP分型，检测并分析新疆汉族2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236共4个VDR SNPs位点基因多态性，探讨VDR基因多态性与DR的相关性。

1　对象和方法

1.1研究对象筛选2014年1月-2015年12月在新疆医科大学第一附属医院眼科及第五附属医院住院患者。纳入标准：(1)新疆地区居住20 a以上的汉族居民；(2)T2DM病程≥3 a者；(3)已接受胰岛素或口服降血糖药物治疗者；(4)同意血样抽取行DNA检查者。排除标准：(1)T1DM患者；(2)急性或慢性炎症者；(3)肾功能衰退者；(4)与已入选对象有血缘关系者。589例新疆汉族T2DM患者入选，其中非增殖性糖尿病视网膜病变患者181例(NPDR组)(年龄49～82岁，DM病程4～31 a，糖化血红蛋白6.5%～8.8%)，增殖性糖尿病视网膜病变患者146例(PDR组)(年龄47～79岁，DM病程4～27 a，糖化血红蛋白6.6%～9.2%)，无糖尿病视网膜病变患者262例(T2DM组)(年龄44～82岁，DM病程4～28 a，糖化血红蛋白5.6%～8.9%)。DR分期标准依据《我国糖尿病视网膜病病变临床诊疗指南(2014年)》[4]。本研究遵循Helsinki宣言，经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会讨论通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂引物(上海生工生物工程公司),Taq DNA聚合酶(Qiagen公司，Inc.),dNTP(GENERAY BIOTECH),PCR反应缓冲液(TAKARA),PCR Marker(NEW ENGLAND BIOLABS),琼脂糖(BIOWEST)等。

1.3方法 1.3.1DNA提取用EDTA试管抽取外周全血5 mL保存于-20℃，提取的DNA保存于-70℃备用。

1.3.2PCR扩增引物序列见表1。PCR条件：反应体系(10 μL)包含1×HotStarTaq 缓冲液、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq 聚合酶、1 μL 样本DNA和1 μL多重PCR引物。反应的热循环条件如下：95℃ 2 min预变性；94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃1.5 min，11个循环；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃1.5 min，24个循环；最后72℃延伸2 min；4℃保存。

表1　引物

1.3.3PCR产物纯化在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h, 然后75℃灭活15 min。连接引物反应体系：10×连接缓冲液 1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、纯化后多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。取0.5 μL 稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz 500 SIZE STANDARD， 9 μL Hi-Di 混匀， 95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems, USA) 来分析。

2　结果

2.1一般资料的比较3组间年龄、性别以及糖尿病病程差异无统计学意义(P>0.05)，3组间糖化血红蛋白差异有统计学意义(P<0.01)，无DR的T2DM组患者糖化血红蛋白最低，见表2。

表2　一般资料比较(±s)

2.2 VDR基因4个SNPs Hardy-Weinberg平衡检验rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236 位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.001)，见表3。

表3　VDR基因4 SNPs Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 VDR基因4个SNPs基因型与等位基因频率分布的比较3组VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ酶切位点基因型与等位基因频率的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。其中3组VDR基因BsmI酶切位点基因型分布均以C/C型最常见，其次是C/T型，C等位基因频率较高；TaqI酶切位点基因型分布以A/A型最常见，其次是G/A型，A等位基因频率较高,见表4。

DR患者与无DR的T2DM患者VDR基因4个SNPs等位基因频率分布的比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。NPDR患者与PDR患者VDR基因4个SNPs等位基因频率分布的比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表43组VDR基因4个SNPs基因型与等位基因频率分布的比较/例(%)

SNP基因型等位基因NPDR组PDR组T2DM组χ2P值rs1544410 C/T27(14.9)26(17.8)37(14.1)-0.412 C/C154(85.1)118(80.8)224(85.5) T/T0(0.0)2(1.4)1(0.4) C335(92.5)262(89.7)458(92.2)1.9540.380 T27(7.5)30(10.3)39(7.8)rs7975232 C/A71(39.2)48(32.9)106(40.5)2.7760.596 A/A18(9.9)17(11.6)30(11.5) C/C92(50.9)81(55.5)126(48.0) C225(67.8)210(71.9)82(28.1)1.5090.475 A107(32.2)358(68.3)166(31.7)rs2228570 G/A71(39.2)68(46.6)111(42.4)4.9940.294 A/A43(23.8)25(17.1)67(25.6) G/G67(37.0)53(36.3)84(32.0) G205(56.6)174(59.6)279(53.2)3.1880.203 A157(43.4)118(40.4)245(46.8)rs731236 G/A27(14.9)26(17.8)37(14.1)-0.414 A/A154(85.1)118(80.8)224(85.5) G/G0(0.0)2(1.4)1(0.4) G27(7.5)30(10.3)39(7.4)2.3410.312 A335(92.5)262(89.7)485(92.6)

注：理论数T<1，或者1≤T≤5的格子数超过总格子数的1/5，选用Fisher确切概率法。

表5　DR与无DR的T2DM患者VDR基因4个SNPs等位基因频率分布的比较/例(%)

表6　NPDR组与PDR组患者VDR基因4个SNPs等位基因频率分布的比较/例(%)

3　讨论

DR是一个多阶段、多基因疾病，发病机制复杂。通常认为DR发生、发展与糖尿病病程、血糖控制情况等因素有关[5]。然而，临床中部分病程长且血糖控制欠佳的T2DM患者并未发生DR，而病程短、血糖控制平稳的患者往往已合并严重的DR，这主要归因于不同个体对于相同病因的遗传易感性不同[6]。因此，研究DR与其相关候选基因的关系及其基因表达差异对早期防治DR有重要的意义。VDR是DR候选基因之一，为亲核蛋白，存在单核苷酸多态性，1,25-二羟基维生素D3是维生素D3的主要活性形式，可与VDR结合，在体内发挥多种生物学效应。研究表明，VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4个SNPs基因多态性与DR密切相关[7]。

新疆当地居民饮食习惯喜好高脂、多盐以及高糖食物, 少食蔬菜而多食面食, 这样长期不合理饮食结构的背景形成了新疆本地居民糖尿病及DR高发的地域特点[8-10]。何菲等[11]研究发现新疆汉族男性、女性及总糖尿病患病率标化率均高于维吾尔族。因此，本研究筛选新疆汉族T2DM人群,通过imLDRTM 多重SNP分型试剂盒对589个样本进行4个SNPs位点分型，检测VDR 基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ酶切位点的多态性，分析基因型及等位基因之间分布差异无统计学意义(P>0.05)。这与Cyganek等[12]和Capoluongo等[13]研究结果相近。但亦有不同意见者。Tavenrna等[1]研究表明，VDR TaqⅠ基因多态性是一种与严重DR发生相关的新危险因子。在C肽缺乏的高加索人中，进展期DR与VDR FokⅠ基因多态性具有相关性[2]。Hong等[3]检测分析537名T2DM韩国患者的VDR基因BsmⅠ(rs1544410)酶切点的多态性，发现等位基因B是T2DM患者发生DR的低危因素。孙京华等[14]研究表明正常人和DR的患者中，VDR TaqⅠ基因存在多态性的差异。乌云娜等[15]研究内蒙古地区蒙古族DR与VDR基因FokⅠ多态性有关联性。本研究与诸多学者研究结果不同，考虑原因为VDR基因多态性存在种族及区域分布差异，可能与人群生活习惯以及所处地理环境有关[16]，亦可能与样本量大小、实验方法以及筛选研究对象的纳入标准和排除标准等不同有关。

另外，本研究还发现，DR患者与无DR的T2DM患者、NPDR患者与PDR患者VDR基因4个SNPs等位基因频率分布的比较差异均无相关性(P>0.05)，故我们认为新疆汉族T2DM人群VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4个SNPs的多态性与DR的发生或DR的严重程度均无关，这为VDR基因多态性与DR相关性研究提供了新的实验依据。

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(本文编辑张巧莲)

Association between vitamin D receptor gene polymorphisms in 4 SNPs and diabetic retinopathy of type 2 diabetes mellitus in Han population in Xinjiang

LI Li1, YI Xianglong2, QIAN Yi2, ZHOU Wei2, ZHAO Chunhuan2, MEI Bo2

(1DepartmentofOphthalmology,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate association between BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ and TaqⅠ polymorphisms in vitamin D receptor (VDR) gene and diabetic retinopathy (DR) of type 2 diabetes mellitus (T2DM) in Han population in Xinjiang. Methods589 patients of T2DM in Han population were screened， including 181 patients with nonproliferative retinopathy (NPDR), 146 patients with proliferative retinopathy (PDR), and 262 patients without diabetic retinopathy. DNA was extracted from blood samples. BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ and TaqⅠ polymorphisms in VDR gene were genotyped using iMLDR technique. Allele and genotype frequencies were compared among three groups using the χ2test. ResultsThe genotype and allele frequencies of rs1544410, rs7975232, rs2228570 and rs731236 were not different among three groups (P>0.05). ConclusionThere were no correlation between BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ, and TaqⅠ polymorphisms in VDR gene and DR of T2DM in Han population in Xinjiang.

diabetic retinopathy; Vitamin D receptor; gene polymorphisms

国家自然科学基金(81260150，81560161)； 国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类(20126517120004)； 中国博士后科学基金面上资助项目(2014M562485)； 新疆医科大学第一附属医院青年科研基金(2012QN08)

李丽(1980-)，女，硕士，主治医师，研究方向：眼底疾病诊断与治疗。

易湘龙，男，主任医师，副教授，硕士生导师，研究方向：眼底病近视矫正及角膜移植，E-mail: xly1010@sina.com。

1,25-二羟维生素D3及其受体基因多态性在新疆维吾尔族糖尿病视网膜病变患者发病中作用及机制的研究

R77; R34

A

1009-5551(2016)09-1081-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.001

2016-03-16]

专题研究作者简介：易湘龙，男，汉族，博士，主任医师，硕士研究生导师。现任新疆医科大学第一附属医院眼科副主任，中华医学会眼科学分会全国青年委员、新疆医学会眼科分会常委。2011年获得中山大学中山眼科中心眼科学博士学位。

从事眼科临床教学科研工作近15年，熟悉眼科各类疾病的诊断治疗，尤其在眼底病的诊断治疗、屈光不正的手术矫正、角膜移植等领域具有较丰富的临床经验。为新疆医科大学第一附属医院学科骨干，先后主持国家自然科学基金项目2项，中国博士后科研基金1项，教育部博士点新教师项目1项，中华医学会课题1项。发表SCI论文4篇。2013年被授予新疆医科大学第一附属医院科技之星称号。2014年获得自治区优秀自然科学论文二等奖、新疆医科大学青年科技新星称号，并入选自治区天山英才工程(第三层次)人才梯队。2014年度被评为新疆医科大学第一附属医院优秀带教老师，现受聘为新疆医科大学第一附属医院住院医师规范化培训督导专家。

糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症, 也是最常见的致盲性眼病之一。易湘龙副教授及其带领的团队一直从事活性维生素D3(1,25(OH)2D3)与糖尿病视网膜病变发病的相关研究，DR发病原因复杂，越来越多的研究表明DR的发病与免疫和低度炎性反应有关。活性1,25(OH)2D3具有免疫调节的作用，可通过细胞表面的受体(VDR)对免疫细胞发挥复杂的调控作用，如抑制T细胞增殖，抑制炎症因子的表达，从而减轻或抑制免疫或炎症反应的发生。本课题以DR为研究对象，以1,25(OH)2D3及VDR为切入点，探讨患者血清中1,25(OH)2D3)表达水平的差异；探讨1,25(OH)2D3对DR患者单个核细胞和CD4+T细胞增殖及细胞因子分泌的影响，阐明1,25(OH)2D3)在DR发病过程中的免疫调节作用；探讨VDR基因多态性与DR的相关性，从基因易感性层面揭示其作用。本研究将可能回答免疫反应在DR发病过程中是否起作用及可能的作用机制，可能为DR的防治提供新的靶点和切入点。