新疆维药芹菜根中3种黄酮苷元含量的测定

王小新， 刘　盟， 韩　丽， 田　莉,4

(1新疆乌鲁木齐市中医医院南门二部药剂科， 乌鲁木齐　830001； 2新疆医科大学附属肿瘤医院； 3新疆医科大学中医学院；4新疆名医名方与特色方剂学重点实验室, 乌鲁木齐　830011)



新疆维药芹菜根中3种黄酮苷元含量的测定

王小新1， 刘盟2， 韩丽3， 田莉3,4

(1新疆乌鲁木齐市中医医院南门二部药剂科， 乌鲁木齐830001；2新疆医科大学附属肿瘤医院；3新疆医科大学中医学院；4新疆名医名方与特色方剂学重点实验室, 乌鲁木齐830011)

目的建立测定新疆维药材芹菜根中3种酸水解黄酮苷元含量的反相高效液相法(RP-HPLC)法。方法采用DiamonsilTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.4%磷酸(58∶42)，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温28℃，进样量20 μL。结果芹菜根中槲皮素、木犀草素和芹菜素的线性范围分别为0.84～53.44 (r=0.999 9)、0.81～51.84 (r=0.999 8)、0.90～57.60 μg/mL(r=0.999 9)，平均加样回收率分别为98.24 % 、98.42%和99.34%，RSD (n=6)分别为1.05%、1.25% 和1.70%。芹菜根样品中槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量分别为 0.09～0.11、0.25～0.27、3.70～3.81 mg/g。结论本法操作简便、快速、准确、重现性好，可为维药材芹菜根及其制剂的质量标准研究提供参考。

芹菜根；黄酮苷元；反相高效液相色谱法；含量测定

芹菜(Apium L.)为伞形科药食同源的植物，我国栽植有旱芹(Apium graveolens L.)和细叶旱芹(Apium leptophyllum) 2种[1]，分布于新疆的主要为旱芹，已收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(维吾尔药分册)[2]。维吾尔医习用旱芹的干燥根入药，认为芹菜根性干热，具有健脑安神、活血通经、祛风除湿等功效，可治疗高血压、腹水、肾脏疾病、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎等症[3]。芹菜根含有黄酮类、三萜类、甾体、糖类、苷类、有机酸、内酯等化学成分，所含黄酮类化合物具有护肝、降压、降脂、抗氧化、抗菌、抗病毒、保护血管和抗肿瘤等作用[4-8]。本研究采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定芹菜根中3 种水解黄酮苷元芹菜素、槲皮素和木犀草素的含量，为芹菜根药材及其制剂质量标准研究提供参考。

1　仪器与材料

1.1仪器Agilent 1220 LC 高效液相色谱仪， UV检测器，二元泵(美国Agilent公司)，XS105型电子天平(德国梅特勒-托利多仪器有限公司)，KQ-5200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂与药材槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号：100081-200907)，木犀草素(中国药品生物制品检定所，批号：111520-200504)，芹菜素(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：Q-077-150720)，维药材芹菜根购于新疆参茸药业有限责任公司，经新疆医科大学乌莉娅·沙依提教授鉴定为伞形科植物旱芹(Apium graveolens L.)的干燥根，甲醇(色谱纯，美国Fisher)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.4%磷酸(58∶42)，检测波长357 nm，柱温28℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素、木犀草素、芹菜素对照品适量，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，依次得到质量浓度为115.20、106.88、103.68 μg/mL的混合对照品储备液。

2.2.2供试品溶液的制备称取干燥的芹菜根药材粗粉(40目筛)1.000 g ，置于 50 mL 磨口锥形瓶中， 加甲醇-25% 盐酸 (v/v，4∶1) 混合液50 mL，超声30 min，转移至 250 mL 烧瓶中，密塞， 称重，90℃水浴锅回流1 h，取出，放冷，称重，加50%甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，备用。

2.3方法学考察

2.3.1专属性按“2.1”项下的色谱条件，分别对对照品、供试品溶液进行HPLC测定，记录色谱图，见图1、2。结果表明，对照品中各成分的保留时间与芹菜根酸水解样品中各成分的保留时间一致，槲皮素、木犀草素、芹菜素理论塔板数均>20 000，色谱峰对称因子均在0.95～1.05之间，与相邻组分峰的分离度均>1.5。

2.3.2线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液适量，分别加50%甲醇依次对倍稀释，制成系列对照品混合溶液， 按“2.1”项下色谱条件进样测定。分别以峰面积(A)对质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。

表1　芹菜根中3种黄酮苷元线性关系考察

2.3.3精密度考察取同一份混合对照品溶液(槲皮素、木犀草素、芹菜素浓度依次为26.72、25.92、28.80 μg/mL，按照“ 2.1 ”项下色谱条件连续进样，3个色谱峰峰面积RSD值(n=6)分别为1.81%、1.47%、1.51%， 仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验取同一份芹菜根供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h后进样分析，进样量20 μL，芹菜素、槲皮素、木犀草素峰面积RSD值(n=6)分别为1.79%、1.39%、1.62%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5重复性试验取同一批芹菜根(批号：20141201)粉末1.00 g，精密称定6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测 定，供试品中槲皮素、木犀草素、芹菜素RSD值分别为1.17%、0.97%、1.08%，方法的重复性良好。

2.3.6加样回收率试验取同一批芹菜根(批号：20141201 )粉末6份, 每份1.000 g，准确加入槲皮素、木犀草素、芹菜素对照品适量， 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液， 按“2.1”项下色谱条件进样测定， 计算回收率。槲皮素、木犀草素、芹菜素的平均加样回收率(n=6)分别为98.24 %、98.42%、99.34%，RSD值(n=6)分别为1.05%、1.25%、1.70%。回收率试验符合要求，方法准确可行，见表2。

表2　加样回收率试验结果(n=6)

2.4样品含量测定取3批新疆和田产维药芹菜根粉末1.00 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别计算芹菜素、槲皮素、木犀草素的含量，见表3。

表3　新疆维药材芹菜根中3种黄酮苷的含量/(mg/g)

3　讨论

大部分黄酮类化合物在植物中与糖结合成苷类，小部分黄酮类化合物以游离形式(苷元)存在，在体内黄酮苷一般在肠道菌群作用下水解成苷元。由于黄酮苷的结构不易确定，也不易获得对照品，一般采用盐酸法和酶法水解黄酮苷释放出黄酮苷元，以测定黄酮苷元的含量评价黄酮含量[9]。

目前对芹菜地上部分的研究较多，芹菜茎、叶、籽中含有挥发油、黄酮、丁基苯酞类等多种化学成分[10-11]，而维吾尔医习用芹菜根入药，其化学成分与地上部分不尽相同，制剂时多为水煮方式，挥发油含量很少，而对芹菜根所含黄酮类成分的定量测定未见报道。依据文献[12-13]和预实验，本研究采用盐酸法水解芹菜根药材中所含黄酮苷获得芹菜素等苷元，考察了甲醇-25%HCl(v/v，7∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1)及水解时间(10、30、60、90 min)对回流提取药材中所含黄酮苷元含量的影响。结果表明，当甲醇-25%HCl体积比为4∶1，水解时间60 min时，测得的黄酮苷元含量最高。对比水解前后芹菜根中3种黄酮苷元的含量，水解后芹菜素、槲皮素和木犀草素的含量显著增高，芹菜素含量变化明显，未水解时芹菜素含量为1.03 mg/g，水解后芹菜素含量为3.75 mg/g，含量增大了3倍多。同时，芹菜根中黄酮类化合物多以苷的形式存在，其中芹菜素含量较高。本实验采用HPLC对新疆维药芹菜根中的3个主要黄酮苷元成分进行定量测定，通过二极管阵列检测器(DAD)在200～400 nm全波长扫描，比较了3种黄酮苷类成分在各波长下的紫外吸收差异，对比文献[14]和试验结果，芹菜素的最大吸收波长在 340 nm 和 258 nm ；槲皮素的最大吸收波长在 374 nm 和 254 nm ；木犀草素的最大吸收波长在354 nm 和254 nm ，实际检测中发现在254 nm处样品的干扰较多，最终确定检测波长为357 nm。本实验建立了RP-HPLC法,检测新疆维药芹菜根提取物中的3种黄酮类成分的方法，方法学考察结果表明，该法专属性、稳定性、重复性良好，可作为新疆维药芹菜根药材中黄酮苷类成分的含量检测方法。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1985,55(2):6-9.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:维吾尔药分册[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1998:141.

[3]新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准[M].乌鲁木齐: 新疆科技卫生出版社,1993:8.

[4]杨映雪,陈建业,王亚平.黄芪总黄酮的抗氧化作用[J].川北医学院学报,2007,22 (6):606-608.

[5]韩丽,田莉. 维药芹菜根研究概况[J].中国中医药信息杂志,2016,23(4):124-126.

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[7]柴黎明,田莉,李勇,等.维药芹菜根醇提物的降压作用研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2010,16(11):101-103.

[8]刘飞,陈妍,林伊梅,等.维药芹菜根提取物对高脂血症大鼠血脂的调节作用[J].新疆中医药,2011,29(5) :52-54.

[9]伍毅.王洪新.朱松.β-葡萄糖苷酶法与盐酸法水解银杏黄酮制备黄酮苷元的比较[J].食品科学,2008,29(7):146-150.

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(本文编辑施洋)

Simultaneous determination of three flavonoids aglycones of Apium graveolens L. root in Xinjiang with RP-HPLC method

WANG Xiaoxin1， LIU Meng2， HAN Li3， TIAN Li3,4

(1DepartmentofPharmacy，BranchofNanmen，XinjiangTCMHospitalofUrumqi，Urumqi，830001，China；2AffiatedofTumorHospital，XinjiangMedicalUniversity；3CollegeofTCM,XinjiangMedicalUniversity；4XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescriptionandScienceofFormula,Urumqi830011,China)

ObjectiveA RP-HPLC method was established to simultaneously determine the three flavonoid aglycones of Apium graveolens L. root in Xinjiang. MethodsThe HPLC method was performed on a DiamonsilTMC18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the mobile phase consisting of Methanol -0.4% phosphate acid(51∶42，v/v) at a flow rate of 1. 0 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm a8nd the column temperature was controlled at 28℃. ResultsQuercetin ，luteolin and apigenin could be well separated． The linear range were 0.84-53.44 μg/mL(r=0.999 9)for quercetin，0.81-51.84 μg/mL (r=0.999 8) for luteolin，0.90-57.6 μg/mL(r=0.999 9) for apigenin. The average recoveries were 98.24%、98.13%、99.34% with the RSD of precision were 1.05%、 1.25%， 1.70%, respectively．The contents of quercetin，luteolin and apigenin in Apium graveolens L. root were 0.09-0.11 mg/g (n=3), 0.25-0.27 mg/g (n=3) and 3.70-3.81 mg/g (n=3)， respectively. ConclusionThe method is rapid, accurate and with good repeatability, which provides a reliable reference for the Apium graveolens L. root quality standards research.

ApiumgraveolensL. root； flavonoid aglycones； RP-HPLC； content determination

国家自然科学基金(81460590)； 新疆医科大学博士后科研启动项目(01040060141)

王小新(1970-)，女， 本科，主管药师， 研究方向： 中药学基础研究。

田莉 ，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药民族药新制剂研发，E-mail：tianli109@126.corn。

R914

A

1009-5551(2016)09-1166-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.022

2016-5-18]