VDR基因多态性与维吾尔族糖尿病视网膜病变遗传易感性研究

周　维， 李　丽， 梅　波， 赵春焕， 郑坤坤， 钱　一， 易湘龙

(新疆医科大学1第一附属医院眼科， 乌鲁木齐　830054； 2第五附属医院眼科， 乌鲁木齐　830011)



VDR基因多态性与维吾尔族糖尿病视网膜病变遗传易感性研究

周维1， 李丽2， 梅波1， 赵春焕1， 郑坤坤1， 钱一1， 易湘龙1

(新疆医科大学1第一附属医院眼科， 乌鲁木齐830054；2第五附属医院眼科， 乌鲁木齐830011)

目的探讨维生素D受体(VDR)基因多态性与新疆维吾尔族糖尿病视网膜病变(DR)的关系。方法应用iMLDR技术对92例无糖尿病视网膜病变患者(NDR组)、112例DR患者(DR组)和130例健康对照(NC组)VDR 4个基因位点(rs1544410、rs2228570、rs731236和 rs7975232)进行基因分型。结果DR组VDR基因的rs1544410位点CC基因型和rs731236位点AA基因型的频率高于NC组(P<0.05)，rs1544410位点C等位基因和rs731236位点A等位基因的频率也高于NC组(P<0.05)，rs7975232位点的AA基因型和A等位基因的频率较NC组低(P<0.05)，DR组和NC组rs2228570位点的基因型和等位基因差异无统计学意义(P>0.05)；NC组与NDR组、NDR组与DR组VDR 4个位点基因型和等位基因分布无统计学差异(P>0.05)。 结论VDR基因的rs1544410、rs2228570、rs7975232位点的基因多态性可能和DR的发病存在一定的相关性。rs1544410的CC基因型和C等位基因、rs731236位点的AA基因型和A等位基因可能是新疆维吾尔DR患者的易感因素(OR>1)；rs7975232位点的AA基因型和A等位基因可能是新疆维吾尔族DR患者的保护因素(OR<1)。

糖尿病视网膜病变； 维生素D受体； 基因多态性

Keywrods: diabetic retinopathy; Vitamin D receptor; gene polymorphism

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由多因素引起糖代谢紊乱所致的内分泌代谢性疾病，随着经济和生活水平的提高，DM的发病率逐年上升。世界卫生组织在2008年时曾预测到2025年DM患者将达到3.5 亿人[1]。据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2015年全世界已有约4.15亿成年人患有DM，即每11个成年人中便有1人患有DM，我国目前DM患者超过9 240万，已经成为世界上DM患者最多的国家[2]。新疆维吾尔族人喜爱高糖、高脂、高盐的饮食，使其成为糖尿病及其并发症的高发人群。祁燕等[3]流行病学调查显示，新疆乌鲁木齐地区维吾尔族成年人糖尿病发病率高达14.75%。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是DM最常见和最严重的微血管并发症之一。越来越多的证据显示，DR的发生除了与病程和血糖控制不佳有关，包括遗传因素在内的其他发病机制可能也参与了DR的发生和发展，活性维生素D通过与特异性的维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合发挥复杂的调控作用，与DR的发生、发展有密切的关系[4-6]。目前研究表明，与DR关系较为密切的是VDR基因rs1544410、rs2228570、rs731236和rs7975232 4个位点。本研究通过对新疆地区维吾尔族VDR 4个酶切位点基因多态性进行测量和分析，探讨VDR基因多态性与新疆地区维吾尔族DR的相关性。

1　对象与方法

1.1研究对象按照美国糖尿病协会2009年制定的糖尿病诊断及分型标准，选择2013年9月-2015年9月就诊于新疆医科大学第一附属医院就诊并确诊为T2DM的维吾尔族患者204例，根据荧光素眼底血管造影检查结果分为NDR患者92例(NDR组)和DR患者112例(DR组)，并收集同时期的健康个体130例作为NC组。入组者之间无亲缘关系，本研究遵循赫尔辛基宣言并且已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查，所有受试者均签署知情同意书。

1.2实验方法及步骤

1.2.1标本收集采集入组受试者晨起空腹肘静脉血5 mL至EDTA抗凝试管中，-80℃恒温冰箱保存备用。

1.2.2DNA提取取样本10 ng/μL，1% agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度10 ng/μL。

1.2.3多重PCR反应条件反应体系(10 ng/μL)包含10×HotStarTaq buffer、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)、10 ng/μL样本DNA和10 ng/μL多重PCR引物。多重PCR引物中各对引物的浓度均为10 μmol/L。rs7975232和rs731236基因位点物理位置很近，实验中共用一对PCR扩增引物。

1.2.4多重PCR循环步骤95℃2 min 11个循环：94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min，24个循环：94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min；72℃ 2 min。

1.2.5多重PCR产物纯化在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h, 然后75℃灭活 15 min。

1.2.6连接反应连接缓冲液1 μL、高温连接酶0.25 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、纯化后多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL混匀后放入94℃持续1 min，56℃持续4 min，共38个循环(表1)。

1.2.7测序取0.5 μL 稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD， 9 μL Hi-Di 混匀，95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。

1.2.8数据质控在进行样本检测的同时进行设置分子内标、样本双盲以及设置阴性对照确认整个实验过程准确无误；同时对实验得到的SNP分型结果，进行MAF核对、Hardy-Weinberg平衡检验以及连锁分析，以确保数据结果的可靠性，本实验相关生物技术由上海天昊生物有限公司提供。

表1　VDR的SNPs位点对应PCR引物和连接产物

2　结果

2.1一般资料比较NC组、NDR组和DR组的DR病程、高血压病史和文化程度差异有统计学意义(P<0.05)；而3组间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2Hardy-Weinberg平衡检验对本实验样本进行Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检测，结果显示rs1544410、rs731236、 rs2228570和rs7975232基因分型符合HWE平衡，具有群体代表性(P>0.001)。

表2　NC组、NDR组和DR组一般资料比较

2.3NC组、NDR组和DR组VDR基因型和等位基因的频率分布比较NC组与DR组VDR基因和等位基因的分布差异具有统计学意义：rs1544410位点的CC基因型频率分布差异有统计学意义(P=0.038，OR=1.719, 95%CI=1.028～2.875)，等位基因C频率分布差异亦有统计学意义(P=0.012，OR=1.721， 95%CI=1.127～2.629) ；rs731236位点的AA基因型的频率分布差异有统计学意义(P=0.012，OR=1.966，95% CI=1.157～3.341)，等位基因A在两组间的频率分布差异有统计学意义(P=0.001，OR=1.966，95%CI=1.157～3.341)；rs7975232位点的AA基因型频率分布差异有统计学意义(P=0.038，OR=1.719，95%CI=1.028～2.875)，等位基因A频率分布差异亦有统计学意义(P=0.039，OR=0.681, 95% CI=0.474～0.980)，见表3。NC组与DR组rs2228570位点的基因型和等位基因差异无统计学意义(P>0.05)。NC组与NDR组、NDR组与DR组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

新疆维吾尔族是新疆常住民族之一，人口占新疆人口总数的近一半，在日常生活中他们喜爱高脂、高盐和高糖食物的饮食习惯，使其成为T2DM高发人群。Yang等[7]对新疆地区DM大样本流行病学调查研究显示：维吾尔族T2DM发病率高达6.23%，张明琛等[8]研究显示新疆地区DM人平均空腹血糖为(11.1±4.28)mmol/L。这种DM发病率高、血糖控制不佳的现状导致DR发病率升高。目前对于DR发病的确切机制尚未明确，长期慢性高血糖是其发病基础。其可能的机制是长期的高血糖导致血管内皮损伤、细胞黏附分子活化、白细胞聚集和一系列细胞因子活化, 随后缺氧调节的生长因子表达和细胞因子产生增加, 微循环障碍，各种细胞因子相互作用，引发DR的发生与发展。目前有大量的研究发现DR的发生和发展除了与疾病的病程、血糖控制的情况有关外，还存在个体差异[9-11]。有的患者虽然病程较短且血糖控制良好，但仍然发生了严重的增生性DR；相反对有些DM的病程很长且血糖控制不良的患者，在长期的随访过程中并未发生DR或其病变程度很轻。考虑发生这一现象的主要原因是由于遗传基因易感性不同所致。

表3　NC组、NDR组和DR组VDR基因型和等位基因的频率分布

注： P值为NC组与DR组比较。

越来越多的证据显示，遗传因素参与DR的形成与发展，随着基因多态性与糖尿病视网膜病变研究的深入，包括维生素D受体基因在内等数10种与DR相关的基因被相继发现[9-13]。1,25(OH)2D3是体内最重要的维生素D活性代谢产物，又称活性维生素D。活性维生素D除了经典的调节钙磷代谢的作用外，有证据表明活性维生素D是糖尿病的保护因素，2型糖尿病更易于发生在维生素D缺乏的个体[14-18]。1,25(OH)2D3可以通过与特异性的VDR结合发挥复杂的调控作用，与DR的发生发展有密切相关。其可通过对VDR受体的上调而抑制β-细胞的生长，从而改变胰岛素应答[19]，Borissova等[20]研究发现维生素D3的缺乏与胰岛素的分泌障碍有关。本研究前期对维吾尔族DR患者与正常人血清中1,25(OH)2D3的浓度进行检测发现，DR患者血清中的1,25(OH)2D3浓度较正常对照组明显降低，即血清中低水平表达活性维生素D可能是DR的危险因素。另有研究表明，补充活性维生素D可有效改善DR患者视力和眼底病变[21]。

本研究结果显示VDR基因多态性在DR患者与NC患者中差异有统计学意义，而在NC组与NDR组、NDR与DR组中差异无统计学意义，与Cyganek等[22]研究法国1型糖病患者VDR基因多态性与严重DR有关结果一致，提示VDR基因多态性与新疆维吾尔族DR的发病有关。rs731236(TaqⅠ)与DR相关，孙京华等[23]研究表明中国糖尿病患者VDR TaqⅠ多态性与DR有关，Taverna等[24]研究显示TaqⅠ与糖尿病病程>25 a的严重DR相关。Zhong等[25]研究表明VDR基因 rs1544410(BsmⅠ)和rs7975232(AapⅠ)与中国安徽地区汉族人群DR的发病无关，但本研究结果表明这2个基因位点与新疆维吾尔族DR相关。国内雷远[26]研究发现VDR基因FokI位点多态性可能与安徽地区汉族人群DR的发病具有相关性，乌云娜等[27]研究发现VDR的FokI位点的f基因是蒙古族民族糖尿病视网膜病变的易感基因。但本研究中rs2228570(FokI)位点在NC组、NDR组及DR组差异无统计学意义，提示该位点的基因多态性可能与新疆维吾尔族DR的发病无关联。由此可见VDR基因多态性存在着较大的种族差异和区域性差异。新疆地区维吾尔族DR患者的VDR基因多态的表达有其特异性。

在新疆维吾尔族人群中VDR的rs1544410位点的CC基因型和C等位基因rs731236位点的AA基因型和A等位基因在DR组的表达较NC组高，该基因型与等位基因可能是维吾尔族DR易感因素(OR>1)。DR组rs7975232位点的AA基因型和A等位基因表达较NC组低(OR<1)，提示该基因位点的基因型和等位基因的高表达可能是新疆维吾尔族DR患者保护因素(OR<1)。在NC组与NDR组、NDR组与DR组的对比中，VDR的基因型和等位基因的表达频率无统计学差异，提示VDR基因多态性可能与新疆维吾尔族尚未发生DR的糖尿病患者无关联。

综上所述，VDR基因多态性与新疆维吾尔族糖尿病视网膜病变有一定的相关性，基于目前的初步研究检测结果，日后需要加大样本量继续深入研究新疆维吾尔族人群DR患者与相关基因多态性间的关系，进一步从基因的角度阐述DR发病机制，为新疆地区DR的基因诊断及治疗提供依据。

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(本文编辑张巧莲)

Association of VDR gene polymorphisms with diabetic retinopathy in Uyghur population

ZHOU Wei1, LI Li2, MEI Bo1, ZHAO Chunhuan1, ZHENG Kunkun1, QIAN Yi1, YI Xianglong1

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China；2DepartmentofOphthalmology,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the relationship between VDR gene polymorphisms and diabetic retinopathy in Uyghur population with type 2 diabetic mellitus in Xinjiang. MethodsGenotyping for VDR polymorphisms at rs1544410, rs2228570, rs731236 and rs7975232 loci was performed on 92 Non-Diabetic Retinopathy patients, 112 Diabetic Retinopathy patients and 130 Normal Controls by the iMLDR technique. ResultsThe rs1544410 CC genotype and rs731236 AA genotype in DR group were found a increased prevalence than NC group (P<0.05), the frequency of the rs1544410 C allele and rs731236 A allele were also higher in DR group compared with NC group (P<0.05), and the frequencies of the rs7975232 AA genoptype and A allele were lower in DR group than those NC group (P<0.05). There were no significant difference in genotype and allele of rs2228570 locus between DR group and NC group (P>0.05). There were no statistically significant differences (P>0.05) between NC group NDR group, NDR group and DR group about the four SNPs(rs1544410，rs2228570，rs731236 and rs7975232). ConclusionThe VDR polymorphisms at rs1544410，rs731236 and rs7975232 may be have association with DR patients in Uyghur population. The rs1544410 CC genotype and C allele , rs731236 AA genotype and A allele of VDR are associated with susceptibility to DR patients in Uyghur population (OR>1). While the rs7975232 AA genotype and A allele of VDR are protectly associated with DR patients in Uyghur population (OR<1).

国家自然科学基金(81260150，81560161)； 国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类(20126517120004)； 中国博士后科学基金面上资助项目(2014M562485)； 新疆医科大学第一附属医院青年科研基金(2012QN08)

周维(1980-)，女，硕士，研究方向：角膜疾病、眼底疾病。

易湘龙，男，主任医师，副教授，硕士生导师，研究方向：眼底病近视矫正及角膜移植，E-mail: xly1010@sina.com。

R77; R34

A

1009-5551(2016)09-1086-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.002

2016-03-16]