铁岭某奶牛场牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验

2016-09-21王丽娟

动物医学进展 2016年8期

关键词：纸片琼脂金黄色

王丽娟

(辽宁职业学院，辽宁铁岭 112099)

铁岭某奶牛场牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验

王丽娟

(辽宁职业学院，辽宁铁岭 112099)

为了解铁岭某奶牛场牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌的感染情况及对常用药物的敏感性，采集该牛场20头奶牛30份乳房炎的乳样进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，并选取临床应用最广泛的12种抗菌药物的自制药敏片和商品化标准药敏片，采用圆纸片琼脂扩散法(K-B法)进行药敏试验。结果发现，分离到的16株致病性金黄色葡萄球菌，对青霉素钠、土霉素、氨苄西林钠、阿莫西林钠及红霉素等药物具有不同程度的耐受性，建议停用；对硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、盐酸林可霉素等中度敏感，可交替临床用药；对乳酸环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻呋及硫酸庆大霉素等高度敏感，可用于治疗奶牛乳房炎的临床用药。本研究结果为该牛场对乳房炎金黄色葡萄球菌感染的诊断及治疗药物的选择提供了科学依据。

乳房炎；金黄色葡萄球菌；药敏试验；奶牛

奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见、危害最严重、最难防控的疾病之一，不仅影响奶牛的产乳量和乳品质，造成巨大的经济损失，而且还威胁人类健康，影响公共食品卫生安全[1]。引起奶牛乳房炎的主要原因是多种非特定病原微生物的感染，其中以致病性金黄色葡萄球菌感染最为常见，发病率最高，且在奶牛泌乳期间最易感染，多呈慢性经过[2]。该属细菌易变异，对常用的多种抗生素易产生耐药性，增加了乳房炎的防治难度[3]。本研究对铁岭某奶牛场乳房炎患牛样品进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定及分离菌常用药物的敏感性检测，旨在对该地区奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的诊断及治疗药物的选择提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备超净工作台，高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，冰箱，生物显微镜，恒温培养箱，离心机，可调式移液器，电子天平，打孔机，游标卡尺等。

1.1.2培养基及主要试剂营养琼脂、50 mL/L绵羊鲜血琼脂、却蒲曼琼脂、麦康凯琼脂、M-H琼脂平板和营养肉汤(100 mL/L犊牛血清)，用前自行配制；革兰染色液、无菌生理盐水、蒸馏水、30 mL/L过氧化氢；葡萄球菌乳胶凝集检测试剂盒，广东环凯微生物科技有限公司产品；葡萄球菌属生化鉴定管、麦氏比浊管、标准药敏片，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；自制药敏片，选择当地临床上常用的兽用抗菌药物(盐酸头孢噻呋乳房注入剂、注射用氨苄西林钠、注射用阿莫西林钠、注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、硫酸庆大霉素注射液、土霉素子宫注入剂、盐酸林可霉素注射液、恩诺沙星注射液、乳酸环丙沙星注射液、硫酸卡那霉素注射液、注射用乳糖酸红霉素)实验室自行制备。

1.1.3样品来源铁岭某奶牛场20头临床型乳房炎奶牛患病乳区的乳样30份。其中有10头奶牛为2个患病乳区，其余均为1个患病乳区，各患病乳区分别采集乳样。

1.2方法

1.2.1干燥药敏片的制备

1.2.1.1滤纸片的制备选用质量较好的定性滤纸，用打孔机打成直径为6 mm的圆形纸片，每100片为1份，置于洁净的小平皿中，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，放入60℃干燥箱中烘干备用。

1.2.1.2药液的配制选择当地临床上常用的12种兽用抗菌药物，按照药物说明，根据不同药物每片药敏纸片的纯药物含量要求和抗菌药物原液(粉)中药物的百分含量，计算出制备1份即100片药敏纸片需要的抗菌药物原液(粉)的重量。每片药敏纸片的纯药物含量参照美国CLSI药敏试验法规(表1)。

精确称取各抗菌药物后，用无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液进行稀释，将各药稀释至所需浓度，如氨苄西林钠1 mg/mL、环丙沙星0.5 mg/mL、红霉素1.5 mg/mL等。

为验证本文方法在的可行性和有效性，选取条纹密度较高的模拟工程实践中出现的4倍peaks(512 pixel×512 pixel)函数进行仿真，结果如图2.

1.2.1.3含药纸片的制备按每片滤纸片饱和吸水量(一般每片吸收0.01 mL)计算，加入稀释后的药液。无菌吸取氨苄西林钠等稀释后的抗菌药液各1 mL，分别加入装有100片滤纸片的小平皿中，事先将滤纸片摊开，充分浸湿并不时翻动，浸泡1 h～2 h，置于37℃温箱中2 h～3 h烘干并分装于无菌容器中密封后，4℃冰箱保存，不超过1个月。置-20℃冰箱保存，有效期一般为4个～6个月。

1.2.2乳样的采集方法乳样采集前，先用温水清洗乳房，再用2 mL/L新洁尔灭擦洗乳房，最后用750 mL/L酒精棉球对乳头进行擦拭消毒处理。采样者同时用750 mL/L的酒精进行手指擦拭消毒。患病的乳室先弃去头3把乳汁，以排除污染的杂菌，每个病例取乳样约5 mL于无菌带盖的离心管中，乳样编号后放入冰盒中冷藏保存，及时带回实验室。乳样以3 000 r/min离心10 min，弃去管中上层油脂和中层液体，留取底部的沉淀物，4℃保存备用。

1.2.3乳样中病原细菌的分离

1.2.3.1显微镜检查分别取每份乳样的沉淀物涂片、自然干燥、火焰固定、革兰染色、油镜下检查，根据细菌的形态初步判定样品中细菌的类型。

1.2.3.2细菌的分离培养无菌操作用灭菌棉签蘸取乳样沉淀物适量，分别涂抹接种于营养肉汤(含100 mL/L血清)、营养琼脂平板、50 mL/L绵羊鲜血琼脂平板、却蒲曼琼脂平板、麦康凯琼脂平板培养基，置于37℃培养24 h～48 h。观察并记录其培养特性。挑取典型菌落涂片，革兰染色、镜检。根据每个平板中菌落生长的形态特征、菌体形态及染色特性初步判定细菌类属。

1.2.3.3细菌的纯培养挑取革兰阳性球菌、葡萄串状样或短链样排列的单个可疑金黄色葡萄球菌菌落移植于营养肉汤和琼脂斜面培养基进行纯化，经37℃培养24 h～48 h，4℃保藏备用。24 h后无细菌生长的平板，再用相应的增菌肉汤培养一次，24 h～48 h后，再作检查，以防漏检。将剩余的乳样置于4℃冰箱保存备用。将纯培养的菌株再进行涂片、革兰染色、镜检。

1.2.3.4细菌的生化鉴定取上述各种纯化的菌株，进行触酶试验、乳胶凝聚试验、甘露醇发酵试验等葡萄球菌属细菌生化鉴定。

1.2.3.4.1触酶试验滴1滴30 mL/L过氧化氢溶液(现用现配)于洁净的载玻片上，取菌落置于30 mL/L过氧化氢溶液中搅匀，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性，无则为阴性。

1.2.3.4.2乳胶凝聚试验轻轻摇匀葡萄球菌乳胶测试试剂，滴1滴测试试剂于检测板的各反应环内；再用专用的搅拌棒分别挑取24 h培养可疑菌落少许与相应反应环内的乳胶测试试剂混匀，并在整个反应环内涂布均匀；轻摇检测板，在2 min内观察凝集结果。同时用葡萄球菌阳性对照试剂作阳性对照。

1.2.3.4.3糖发酵试验取上述各种纯化的菌株，依据葡萄球菌属细菌的微量生化鉴定管产品说明进行菌种鉴定。试验重复2次。

1.2.3.4.4药敏试验根据美国NCCLS标准，利用药物圆纸片琼脂扩散法(K-B法)，使用0.5单位麦氏标准比浊管对金黄色葡萄球菌肉汤培养物或菌落混悬液进行标定并校正(调节菌液浓度为1.5×108CFU/mL)。用无菌的棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后，在M-H琼脂平板表面密集均匀涂布，在平皿底部标记药物代号，用无菌镊子贴上药敏纸片，轻压纸片使其与培养基表面紧密接触。每个平板贴5张，每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。待纸片吸湿贴紧培养基后，将平皿倒置于37℃温箱中培养16 h～18 h取出，从平皿背面用游标卡尺测量抑菌圈直径大小(mm)。试验菌株对12种抗菌药物纸片的敏感性需参照CLSI最新版本的标准进行判断，以敏感(S)、中敏(I)、耐药(R)报告结果[4]。具体判定标准见表1。

自制药敏片与商品化标准药敏片进行效果对比试验，方法是把同种成分的自制药敏片与商品化标准药敏片放在同一培养皿中，观察其抑菌效果。

表1　金黄色葡萄球菌分离株对不同抗菌药物敏感度判定标准

2　结果

2.1染色镜检

可见菌体呈圆球形，直径0.5 μm～1 μm，呈葡萄串状、双球或短链状排列，无芽胞、荚膜，革兰染色阳性球菌，即可怀疑为葡萄球菌。

2.2培养特性

营养肉汤浑浊，管底有少量灰白色沉淀，轻摇后全部旋起并消散；营养琼脂平板上，37℃培养24 h～48 h后，形成圆形，直径2 mm～3 mm，表面光滑、湿润、隆起的金黄色菌落；却蒲曼琼脂平板上，菌落较大，金黄色；血液琼脂平板上，菌落较大，呈金黄色、圆形，周围出现明显的β溶血；麦康凯琼脂平板上，无细菌生长。挑取典型菌落涂片、革兰染色、镜检，其中16株结果为阳性，呈葡萄串状排列，无芽胞、荚膜。

2.3生化鉴定结果

2.3.1触酶试验阴性对照无气泡产生，16株分离菌株全部出现气泡，即触酶试验结果阳性。

2.3.2乳胶凝集试验16株分离菌均在2 min 内出现凝集，为阳性，表明测试菌落为金黄色葡萄球菌菌落。

2.3.3糖发酵试验16株分离菌的糖发酵试验结果见表2。

表2　糖发酵试验结果

注:“+”表示分离菌株生化反应呈阳性(产酸不产气)；“-”表示呈阴性。

Note：“+” represents positive biochemical reaction for isolated strain(producing acid，not produceing gas)，“-” represents negative reaction.

根据上述结果，依据《伯吉氏细菌鉴定手册》可知，从11头临床型乳房炎奶牛的16个患病乳区乳样中分离所得的菌株均为金黄色葡萄球菌。其中有5头奶牛的2个乳区均分离到金黄色葡萄球菌。

2.3.4药物敏感性试验结果16株金黄色葡萄球菌的药物敏感试验结果见表3，自制药敏片与商品化标准药敏片对分离株的抑菌效果见表4。

由表3可见，金黄色葡萄球菌分离株对青霉素钠耐药率高达100%，这可能与该类抗菌药过度使用有关。对土霉素、氨苄西林钠、阿莫西林钠以及红霉素耐药率分别为75%、69%、63%、56%，建议停用或不再单独使用；对硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、盐酸林可霉素中度敏感，可在临床上交替用药；对乳酸环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻呋钠及硫酸庆大霉素等抗生素的敏感性较高(S>80%)，推荐将这些抗菌药物作为所检测奶牛场的金黄色葡萄球菌乳房炎牛的临床用药。

从表4可见，自制药敏片与商品化标准药敏片虽然有些误差，但差异不显著(P>0.05)，可以当作标准药敏纸片进行临床药敏试验使用。

表3　16株金黄色葡萄球菌分离株对12种抗菌药物的敏感性试验结果

表4　12种抗菌药物的自制药敏片与标准药敏片对金黄色葡萄球菌分离株的抑菌效

注:“-”表示无标准药敏片。

Note: “-” represents no standard drug sensitive pieces.

3　讨论

金黄色葡萄球菌是一种环境型传染性病原菌，其传播主要发生在挤奶过程，主要通过奶牛的乳头导管或乳房皮肤外伤等因素侵入乳房组织引起乳腺发生炎症反应。平时应注意加强饲养管理、改善牛场环境、挤奶设备及牛体卫生，加大对挤奶工的技术培训，提高专业素质和责任心；严格按挤奶程序规范操作；及早发现乳房炎感染牛并及时隔离给予治疗；患乳房炎的奶牛严禁上厅挤奶，防止交叉感染[5]。

目前，临床上主要采用抗菌药物治疗奶牛乳房炎，使得金黄色葡萄球菌产生了耐药性，以及不同地区、不同奶牛场间的金黄色葡萄球菌流行类型不同，对常用的多种抗菌药物的敏感性有较大差异，给奶牛乳房炎的治疗选择用药造成很大困难，因此，通过金黄色葡萄球菌分离培养鉴定、药物敏感试验检测，筛选出最佳治疗药物及时指导临床生产实践非常必要。

本试验采用临床应用最广泛的12种抗菌药物自制药敏片与商品化标准药敏片对乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌进行敏感性对比，结果发现，自制药敏片与商品化标准药敏片结果相差不大，而且自制药敏片制作方法简单，成本低廉，可对各种药物、不同生产厂家的药物进行比较，选择最敏感、吸收好、价格低的药物，能与牛场常用药物完全一一对应，比较实用，值得在基层兽医实验室推广应用。

[1]王林,梅力,韦海涛,等.北京地区奶牛隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展,2015,36(4):124-127.

[2]杨淑华,谭克,于立辉,等.辽宁地区奶牛临床型乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医学报,2015,35(8):1548-1552.

[3]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京:中国农业出版社,2007.

[4]栾智华.盘锦地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].黑龙江畜牧兽医，2014(12):77-79.

[5]王晓,俞英.中国北方奶牛金葡菌乳房炎感染现状及耐药性和流行类型研究进展[J].畜牧兽医学报,2015,46(8):1477-1488.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Staphylococcus aureus from Milk of Mastitis Cows in a Dairy Farm of Tieling

WANG Li-juan

(Liaoning Vocational College, Tieling,Liaoning,112099,China)

In order to know the infection ofStaphylococcusaureusin the milk produced by the cows with mastitis in a dairy farm of Tieling and its sensitivity of common used drugs，30 milk samples from 20 cows with mastitis were collected.The isolation and identification ofStaphylococcusaureuswere made.The drug sensitivity test was made by the method of the circular disc agar diffusion (K-B), the test selected the 12 kinds of drugs most widely used in clinical trials which are self made drug sensitive tablets and commercial standard sensitive tablets. The results showed that 16 strains ofStaphylococcusaureuswere isolated,and different degrees of drug resistance to penicillin sodium, oxytetracycline, ampicillin, amoxicillin and erythromycin were found,these antimicrobials should be stopped;moderately sensitive to kanamycin, streptomycin, lincomcin, these antimicrobials can be alternated between clinical medications; highly sensitive to ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime ceftiofur and gentamycin, these antimicrobials can be used for clinical medication for treatment of mastitis in dairy cows. The results of the study provided a scientific basis for diagnosis and selecting drugs for treatment of mastitis in dairy cows caused byStaphylococcusaureus.

mastitis;Staphylococcusaureus; drug sensitivity test;cow