新生儿金黄色葡萄球菌皮肤和软组织化脓性感染临床分离株分子及毒力特征

2016-09-21耿文静李文婷姚开虎沈叙庄齐宇洁

中国循证儿科杂志 2016年3期

耿文静　李文婷　姚开虎　沈叙庄　齐宇洁

·论著·

耿文静1,3李文婷2,3姚开虎2沈叙庄2齐宇洁1

目的监测新生儿金黄色葡萄球菌(SA)皮肤和软组织化脓性感染(SSTIs)临床分离株的分子和毒力特征，为预防和治疗新生儿SSTIs提供理论依据。方法收集2015年5月至2016年4月首都医科大学附属北京儿童医院NICU临床诊断为SSTIs的病例，对SA分离株进行agr、MLST、spa 和SCCmec 分型；通过PCR对SA菌株进行21种超抗原毒素基因、sasX、PVL基因检测。结果44例SSTIs新生儿，男22例，中位年龄4.5(0～22)d，均为社区获得性感染。共分离出13例SA菌株，其中MRSA 7株，MRSA最常见的克隆是agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa，13株SA包含2～8种超抗原基因型，最常见的毒素基因型为sek-seb-seq，有6株SAPVL基因阳性，均不携带sasX基因。结论新生儿SSTIs中，SA携带率较低， agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa-t437是MRSA最主要的流行克隆，SA分离株超抗原基因携带率高。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；皮肤和软组织化脓感染；毒力；新生儿

新生儿因其特殊的生理特点，表皮的屏障功能不完善，是皮肤和软组织化脓性感染(SSTIs)的高危人群。国内外多项研究表明，金黄色葡萄球菌(SA)是新生儿SSTIs的主要病原[1]。自20世纪90年代末耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)出现以来，MRSA引起SSTIs的显著增加，而MRSA的高度耐药性是新生儿SA感染持续存在且难以清除的重要原因[2]。由于新生儿的免疫功能差，血脑屏障未发育成熟，SSTIs如未及时控制，可引发严重的侵袭性感染(败血症、化脓性脑膜炎等)，本研究前瞻性监测首都医科大学附属北京儿童医院(我院)NICU诊断的SSTIs病例，对SA临床分离株进行分子及毒力特征研究，为预防及治疗新生儿SSTIs提供理论依据。

1　方法

1.1样本来源2015年5月1日至2016年4月1日我院NICU临床诊断为SSTIs的病例，新生儿SSTIs主要包括：结膜炎、脐炎、脓疱疮、皮肤外伤和术后伤口分泌物等，上述疾病诊断标准参照《实用新生儿学》(第4版)[3]。

1.2菌株来源和鉴定对于确诊为SSTIs的病例，用无菌棉签将脓性分泌物或脓肿穿刺液转移至培养基中，通过菌落的形态学对SA进行鉴定。通过凝固酶试验和头孢西丁纸片(每片30 μg，Oxoid)法对其进行筛查。使用PCR方法检测mecA和nuc基因。以纸片法保存菌株，-20℃贮藏，冷冻状态下转运。

1.3SA菌株基因检测对SA菌株行统一基因检测。

1.3.1DNA提取硅胶模型TM基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；溶葡萄球菌素(1 200 U·mg-1)购自BBI 公司。所提取DNA作为所有PCR的模板。

1.3.2PCR及测序采用PTC-200 PCR扩增仪(美国MJ Research公司)行PCR操作。PCR扩增体系(25 μL)：2.5 μL的10×PCR buffer(Mg2+Plus)，1.5 μL的2.5 mmol dNTP混合物，各1 μL的10 μmol·μL-1引物，0.2 μL的5 U·μL-1TaKaRa Taq，2.5 μL的模板DNA。PCR产物在含溴乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪观察和保存结果。扩增目的片段测序由北京天一辉远生物技术公司完成。

1.3.2.1多位点序列分型(MLST)使用PCR检测7个管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。参考Enrigh 等[4]设计引物。退火温度53℃。测序结果在MLST数据网站(http://saureus.mlst.net)上比对等位基因的序列型(ST)。应用eBURSTv3 软件进行菌株亲缘关系分析。

1.3.2.2SCCmec分型和亚型采用Milheirico等[5]提出的多重PCR方法对所有SA分离株进行SCCmec分型及亚型检测。SCCmecⅠ-Ⅴ 型标准株由日本顺天堂大学Teruyo Ito教授赠送。

1.3.2.3spa分型spa分型的PCR引物，上游：5′-GACG-ATCCTFCAGTGAGCAAAG-3′；下游：5′-GCAGCAATTTTGT-CAGCAGTAG-3′。退火温度55℃。测序结果通过数据库(http//www.ridom.de/spas erver)进行spa分型。

1.3.2.4PVL基因检测引物设计参照Lina等[6]方法。退火温度55℃。扩增片段长度433 bp。

1.3.2.5超抗原毒素基因检测及agr分型的测定按照Holtfreter等[7]方法通过6个多重PCR对每株SA进行21种超抗原毒素基因检测及agr分型测定：①sea，seh，sec和tst；②sed，etd，eta和sek；③see，seb，sem，sel和seo；④sen，seg，seq和sej；⑤sei，ser，seu和sep；⑥agr-Ⅰ至agr-Ⅳ。退火温度55℃。用超抗原基因阳性的SA标准株作为阳性对照，用SA 8325-4作为超抗原基因阴性的对照。德国Greifswald大学Bröker教授馈赠了所有对照菌株。

1.3.2.6SasX基因检测引物参照2010年对ST239测序完成的SATW20_21850序列[8]进行设计。退火温度56℃。扩增片段长度522 bp。

1.4临床资料采集收集SA菌株基因检测阳性的SSTIs病例的临床资料，①性别，年龄，感染疾病。②根据诊断SSTIs时点距入院时间判断医院感染或社区获得性感染，参考美国CDC社区获得性感染定义[9](从门诊或从住院48 h内的患儿中分离出来的菌株；同时没有SA感染或定植的病史，无永久的留置设备，如导管或其他穿通皮肤的医疗用具)。③根据采集标本时点新生儿日龄判断早期新生儿(≤7 d)与晚期新生儿(>7 d)的SA携带。

2　结果

2.1一般情况我院NICU共收集到44例临床诊断为SSTIs新生儿，男女各22例，中位年龄4.5(0～22) d，其中早期新生儿16例，晚期新生儿28例。44例均为社区获得性感染，其中结膜炎17例，脐炎14例，脓疱疮7例，皮肤外伤4例，术后伤口分泌物2例。44例SSTIs病例中(脓性分泌物35例，脓肿穿刺液9例)检出SA 13例(脓性分泌物9例，脓肿穿刺液4例)。13例SA菌株中，其中男4例，女9例；来自脐炎5例，脓疱疮及结膜炎各4例；早期新生儿2例，晚期新生儿11例。

2.2SA分离株的分子特征13株SA中，ST分子分型有5种，分别为ST59 7株，ST217和ST1各2株，ST1281和ST398各1株。MRSA有7株，其中ST59 5株，ST217 2株；SCCmecⅣ型 4株(均为SCCmecⅣa亚型)，SCCmecⅤ型3株。

13株SA中，spa分型有6种，分别为t437 5株，t114、t548和t309各2株，t164 和t034各1株。7株MRSA中，t437 5株，t309 2株；13株SA中agrⅠ型9株，agrⅡ及Ⅲ型各2株，7株MRSA均为agrⅠ型。

7株MRSA中，agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa -t437 4株，agrⅠ-MRSA-ST217-SCCmecⅤ-t309 2株，ST59-SCCmecⅤ-t437 1株。

2.3SasX、PVL及超抗原毒力基因携带情况13株SA分离株中，均不携带sasX基因，有6株显示PVL阳性(均为MRSA)。6例PVL阳性的MRSA分离株中，4例来源于脓疱疮新生儿，另外2例分别来源于脐炎及结膜炎新生儿。

13株SA中，包含2～8种超抗原基因，10株携带3种以上超抗原基因，7株携带4种以上超抗原基因，8株携带sei基因，未发现etd、eta、see、sel、seu和sep基因。有3株SA携带sek-seb-seq基因型，同一agr、ST、SCCmec、spa型中可有1～3种超抗原基因谱, 4株agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437型菌株中共有3种基因谱，分别是sek-seb-seq(2株)，seq-sej(1株)，seb-seq(1株)。

3　讨论

SA是SSTIs的主要致病菌之一，国外已有多项研究报道了新生儿SSTIs中SA暴发流行。在意大利新生儿SSTIs中SA的分离率为77%(339/441)，美国为61%(195/321)，日本MRSA分离率为87%(104/120)[10]。世界范围内SA引起的SSTIs主要是脓疱疮和蜂窝织炎[11]。本研究中SA的分离率为29.5%(13/44)，较国外报道偏低。

MLST是针对SA的7个管家基因arcC，aroE，glpF，gmK，pta，tpi和ypil进行的分型，目前已经建立了国际大型的数据库网站(http://www. mlst.net)，以利于不同国家和地区SA分子特征的比较。目前，MLST广泛应用于SA，对了解其遗传背景及可能的来源有很大帮助。SCCmec是一种携带mecA基因的可移动基因元件，可以整个的从染色体中自发剔除，也可以从1株菌细胞染色体转移整合至另外1株菌细胞染色体中。目前根据mec复合体和ccr复合体将其分为11种SCCmec类型(Ⅰ～Ⅺ型)，spa是编码SA细胞壁蛋白的基因， spa分型既可用于MRSA分子克隆计划的研究，也可用于医院MRSA暴发流行的检测[12]。

有研究表明不同地域SSTIs中MRSA流行株基因型不同，来源于美国和加拿大SSTIs的MRSA主要为ST8型[13]，欧洲主要是ST80型，在瑞典、德国、西班牙、希腊、日本、中国香港和新加坡主要是ST30型[14]。本课题组前期研究发现中国儿童MRSA的流行克隆主要是ST59- SCCmecⅣa-t437[15]，而本研究发现新生儿SSTIs MRSA分离株中最常见克隆也是ST59-SCCmecⅣa-t437，与前期研究结果一致，与其他国家和地区有明显不同。

MRSA可产生多种与感染相关的外毒素，包括超抗原毒素、溶细胞毒素以及抗吞噬的微生物表面组分等，超抗原毒素能够显著改变宿主的免疫功能，能够诱发高热，增强宿主对毒素杀伤效应的敏感性，并诱导T细胞增殖[16]。超抗原基因位于可移动遗传元件(MGEs)上，如致病岛、噬菌体和质粒上，可在菌株间通过水平转移传递，本研究13株SA均携带2～8个超抗原基因，表现出明显的多样性。日本最常见的克隆为ST5型，seo基因是最常见的超抗原基因；西班牙ST125型最常见，sec基因是最常见的超抗原基因，美国CC8型最常见，ser基因是最常见的超抗原基因[17]，本研究中ST59型最常见(7/13)，sei基因的携带率最高。造成这一差异的原因为超抗原基因的携带多与克隆相关，不同地理来源的菌株克隆分布有很大差别。sek-seb-seq位于致病岛SaPI1上[18]，本研究3株SA中检测到sek-seb-seq基因型，表明这些菌株包含有致病岛SaPI1。同时发现1株SA携带有sek-seb-seq中的1或2个基因，说明可能在SaPI1的基础上，出现了新的变异体，另外有9株SA携带有其他基因，说明这些菌株上存在携带其他超抗原基因的MGEs，是菌株在进化过程中基因重组的结果。

PVL在MRSA致病中的作用存在争议。Archer等的[19]研究表明PVL并未在小鼠皮肤感染模型中发挥重要作用，本研究发现13株SA中有6株PVL阳性，但由于样本量较小，未得出PVL与临床疾病相关性分型。2010年英国Holden等对英国医院环境内暴发流行MRSA ST239克隆株进行了全基因组测序，发现了一种新的细胞壁锚定蛋白，将其命名为SA表面蛋白X(SasX)，编码15 kDa的分泌型表面锚定蛋白，已有文献报道MRSA的流行传播与SasX密切相关[20]。目前已有报道sasX基因在小鼠皮肤脓肿、肺炎中起重要的作用[11]，本研究13株SA均不携带sasX基因。

综上所述，新生儿SSTIs中，SA携带率较低，agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa-t437是MRSA最主要的流行克隆，SA分离株超抗原基因携带率高。

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(本文编辑：张崇凡)

Molecular and virulence characterization of methicilin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from neonates with skin and soft tissue infection

GENGWen-jing1,3,LIWen-ting2,3,YAOKai-hu2,SHENXu-zhuang2,QIYu-jie1

(1DepartmentofNeonatology,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045；2BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingPediatricResearchInstitute，NationalKeySubjectsofPediatrics，KeyLaboratoryofMajorDiseaseoftheMinistryofEducation,Beijing100045,China；3Co-firstauthor)

QI Yu-jie，E-mail:qiyj0805@yeah.net

AbstractObjective To investigate the molecular and virulence characterization ofStaphylococcusaureus(SA) isolated from neonates with skin and soft tissue infections(SSTIs) through one-year prospective surveillance study, and to provide the scientific evidence for prevention and control of SA infection. MethodsCases of SSTIs in neonates were prospectively collected from May 2015 to April 2016 in NICU of Beijing Children′s Hospital, the clinical data were recorded, the multilocus sequence typing(MLST) and Staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec) types were analyzed by multiplex polymerase chain reaction method, the spa type was analyzed by PCR. PCR was also used to test 23 virulence genes, including 21 superantigen genes,PVLgene andsasXgene.ResultsA total of 13 SA strains were collected, including 7 MRSA，the most common clone of MRSA was agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437. It was found that all strains contained at least two superantigen toxin genes, and 6 strains werePVLpositive.SasXwas not detected in any of the isolates. ConclusionThe carrying rate of SA from SSTIs in neonates was low, the most common clone of MRSA was agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437, the carrying rate of superantigen was high.

Methicillin-resistantStaphylococcusaureus; Skin and soft tissue infections; Virulence;Neonate