补肾护肝法对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用

朱星瑜　管斯琪　傅天啸　刘　潇　陈　卓

·基础研究·

补肾护肝法对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用

朱星瑜管斯琪傅天啸刘潇陈卓

目的 观察补肾方对酒精性脂肪肝模型大鼠血清酶活力及肝脏指数的影响，探讨本处方对酒精性脂肪肝的保护作用。方法 以56°红星二锅头酒（10ml/kg，2次/d，连续 8周）的方法建立酒精性脂肪肝大鼠模型。8周后将造模成功大鼠分为模型对照组、海王对照组（金樽海王片）、补肾方（熟地、巴戟天、仙灵脾）高、中、低剂量组，分别以（3.0g/ml）10ml/（kg·d）、（1.5g/ml）10ml/（kg·d）、（0.75g/ml）10ml/（kg·d）灌胃处理；模型对照组用等量的蒸馏水，连续给药4周，同期设正常对照组。给药结束后，禁食12 h，取肝脏检测肝脏指数，门静脉取血检测血清 γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）活力。 结果 与空白组比较，模型组肝脏指数、γ-GT、ALT及AST 活力显著升高（P＜0.05），体质量显著降低（P＜0.05）； 中药高、中、低剂量组、海王组肝脏指数、γ-GT、ALT及AST 活力较模型组显著性降低（P＜0.05），体质量显著性上升（P＜0.05）。 结论 补肾方能降低γ-GT、ALT、AST活力，减少肝脏脂肪的蓄积，降低对肝细胞的损伤，对酒精性脂肪肝确有保护作用。

补肾方 酒精性脂肪肝 γ-谷氨酰转移酶 天冬氨酸转氨酶 谷丙转氨酶

酒精性肝病是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病。酒精性脂肪肝（AFL）是酒精性肝病中最早出现、最为常见的病变。若不及时有效控制将会发展成为各种病变，严重威害健康。AFL是酒精性肝病的初期可逆阶段［1］，作者选用补肾方，通过中医理论补肾养肝，利用熟地、巴戟天、仙灵脾煎剂干预酒精性脂肪肝大鼠模型。给药4周后观察大鼠的形态，解剖立取肝脏检测肝脏指数，并于门静脉采血分离血清，检测血清γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及丙氨酸转氨酶（ALT）的水平，观察补肾方对大鼠酒精性脂肪肝是否具有保肝作用。

1　材料与方法

1.1实验动物 52只6周龄雄性SD大鼠，体重（180±20）g。由浙江中医药大学动物实验中心统一购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.2仪器与实验环境 TDL-4 低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），FJ200-S高速均浆机（上海标本模型厂），SK-1 混匀器（常州国华电器有限公司），OLYMPUS AU640全自动生化分析仪（日本奥林巴斯光学株式会社），大鼠屏障系统实验饲养室，温度（22±1）℃，湿度（60±10）%，噪音＜50dB，光照150～200Lx，12h明暗交替。

1.3药品 补肾方煎剂的制备：煎剂由熟地30g、巴戟天15g、仙灵脾15g组成，加水浸泡2h，煎沸30min/次，煎煮2次，合并煎液，静置，取上清液，加热浓缩成含生药为3.0g/ml的制剂，4℃冰箱保存。饮片由浙江省中医院药房提供；海王金樽片（深圳市海王健康科技发展有限公司）；红星二锅头酒（北京酿造总厂），ALT 试剂盒、AST试剂盒、γ-GT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4分组及造模方法 同日购进52只6周龄雄性SD大鼠，体重（180±20）g。适应性喂养1周后，将52只大鼠随机分成空白组和模型组，其中空白组10只，模型组42只。模型组用56°红星二锅头酒按10ml/ kg灌胃，上午及下午各1次（每次大致相隔10～12h），连续8周；空白组用等量蒸馏水灌胃，灌胃时间相同，连续8周。所有大鼠均采用常规饲料及饮水。8周后分别从空白组和模型组中随机抽取大鼠2只，脊椎脱臼处死，立刻取肝脏，经组织病理学证实造模成功［2］。第9周起，将40只造模成功的大鼠随机分为5组，分别为模型对照组、中药高、中、低剂量组和海王组，每组8只，该5组及空白组仍然按照之前的方法喂养。中药高剂量组用熟地、巴戟天、仙灵脾煎剂（3.0g/ml）10ml/（kg·d）灌胃处理；中药中剂量组用煎剂（1.5g/ ml）10ml/（kg·d）灌胃处理；中药低剂量组用煎剂（0.75g/ ml）10ml/（kg·d）灌胃处理，海王组用金樽海王片按1.5g/kg灌胃处理，模型对照组和空白组用等量的蒸馏水，方式均为灌胃。每周称重，根据实验情况适当调整用药量。

2　结果

2.1大鼠一般情况 正常组大鼠毛色润泽，活动敏捷，能迅速对外界刺激做出反应，正常饮食饮水，大便量、质均正常，生长正常。模型组大鼠灌酒后反应变迟钝，甚至对外界刺激无应答，行动迟缓，活动减少表现为嗜睡。灌胃4周出现毛色黄暗无光泽，进食饮水均减少，体质量变化不明显甚至减轻，粪便有酒味。

2.2体质量及肝脏指数的变化 与正常组比较，模型组大鼠体质量显著下降，而肝脏指数显著上升（P＜0.05）。用药后，中药三组和海王组体质量较模型组显著上升，而肝脏指数显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），可见该中药与海王金樽片均取得疗效。见表1。

表1　各组大鼠体质量及肝脏指数比较（x±s）

2.3补肾方对血清酶活力的影响 与空白组比较，模型组γ-GT、ALT及AST活力显著上升（P＜0.05），可见模型组大鼠肝脏确有损伤； 与模型组比较，中药各组及海王组γ-GT、ALT及AST活力显著下降（P＜0.05），可见两种药物对大鼠酒精性脂肪肝均有保护作用。见表2。

表2　各组大鼠γ-GT、ALT、AST活力比较（x±s）

3　讨论

酒味甘、辛、苦，性温热，可舒筋活络，止痛散寒，温通经脉［3］。中医认为酒为水谷所酿，乃谷食之精气，其性湿热，其气剽悍，入心、肝、肺、胃经，并指出酒有大毒。随着社会生活的发展和人们生活方式的改变，酗酒者不断增多，酒精性脂肪肝的发生也呈现迅速上升的趋势。中医历代经典中并无与酒精性脂肪肝相对应的病名，通过分析酒精性脂肪肝的临床证候和症状，根据相关文献记载描述，应属肝积、肝雍、肥气、痞气、积气等病范畴［4］。酒精性脂肪肝的形成，是由于酒热湿毒之邪损伤中焦脾胃，中焦气机不畅，而致土壅木郁。肝脾同病，则清阳不升而浊阴不降。气机运行不利则血行不畅，故此病常表现出气滞血瘀、湿阻郁热等证候症状。

现代研究表明，酒精在肝内代谢，主要通过微粒体氧化酶和乙醇脱氢酶两大系统，代谢过程中产生的乙醛会导致还原型辅酶I增多，从而抑制脂肪酸氧化，三酰甘油在肝内形成过多导致脂肪肝。过量的乙醛和脂质过氧化可直接损伤肝细胞，形成酒精性脂肪肝［5］。γ-GT 被认为是诊断酒精性肝损害较为敏感且具有一定特异性的指标［6］，血清中的γ-GT主要来源于肝胆系统，大量持续饮酒可引起γ-GT升高［7］。肝细胞被破坏后 ALT 和 AST 会被释放至血液中，使血清中 ALT、AST 活力增加［8］。ALT 和 AST 活力是肝细胞损伤最敏感指标之一［9］。

中医学根据五行学说，将五脏进行归属，以木、火、土、金、水对应五脏，以五行特性来说明五脏的生理活动特点，并根据五行之间相互的生克制化关系，说明并解释人体五脏之间生理功能的内在联系，取自然现象“水能生木”来进行类比，提出“肾（水）之精以养肝（木）”的理论［10］。肝血的滋生依赖于肾精，肾藏精，精可化血，同时肾主骨生髓，骨中精髓又可与血液相互化生转换，滋养肝血，故通过补肾中药治疗肝病具有一定的科学性。钱英重视“肝肾同源”在慢性肝病中的应用，临床上治疗慢性肝病中即提出“肝病固肾”的观点，认为“见肝之病，其源在肾，急当固肾”［11］。王灵台等［12］认为临床上各类慢性肝病虽各自有异，但都具有“肾虚证”的共同表现，提出补肾是慢性肝病治疗过程中的重要治疗法则，并符合肝病的病理机制。李瀚旻等［13］探讨了补肾方（左归丸）对同种异性骨髓移植小鼠肝再生相关信号通路的影响，其研究结果证实左归丸可同时对多个信号通路产生影响，说明中医学补肾法对肝再生具有促进和调节作用。余文景等［14］通过实验研究肝肾归经中药的水溶性成分（地黄多糖、车前子多糖、淫羊藿多糖、菟丝子多糖）对大鼠肝脏干细胞生长、分化情况的影响，证实特定浓度下可促进成体大鼠肝脏干细胞的增殖，亦是“肝肾同源”理论的应用。

长期饮酒过量，会使人体内阳热盛、生痰湿，酿成湿热。这一认识与朱丹溪经临床实际体会提出“阳常有余，阴常不足”的论说具有一致性。熟地补阴益精以生血，为养血补虚之要药。阴虚导致阳盛，滋阴以补阴虚，生血以助行气，有利于祛湿散热；巴戟天和仙灵脾均具有补肾助阳、强筋壮骨和祛风除湿的功效，阳能化湿，而肾又主一身阴阳之根本，通过补肾阳以达到助阳化湿的目的。因此该补肾方对酒精性脂肪肝具有保护效果，对指导临床具有一定的意义。

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2 罗华丽，周萍，贾剑锋，等.双葛解酲丸对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用.中国实验方剂学杂志，2012，18（4）：180～182.

3 邱皓，吕晓云，刘文，等.中药活血利湿方对酒精性肾损害的干预作用.中国实验方剂学杂志，2010，16（18）：187.

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8 邸琳，刘新宇，金向群，等.酒肝清胶囊对实验性大鼠酒精性脂肪肝的治疗作用.中国实验方剂学杂志，2008，14（3）：53.

9 黄俊杰，王彩冰，黄丽娟，等.bFGF对慢性酒精中毒大鼠血清ALT、AST活性的影响.中国当代医药，2010，17（27）：7.

10 王耀光.“肝肾同源”论初探.中医杂志，2008，49（1）：5～7.

11 张秋云，张润顺.钱英教授肝病固肾经验的临床应用研究.中华中医药学会第十五届内科肝胆病学术会议暨国家中医药管理局专科专病协作组（肝病组、传染病组）会议论文汇编，2012.

12 王灵台，陈建杰，高月求，等.补肾法为主治疗慢性肝病的临床研究A首届国际中西医结合肝病学术会议论文汇编，2005.

13 李瀚旻，桂文甲，李晶津，等.左归丸对同种异性骨髓移植小鼠肝再生相关基因信号通路的影响.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（31）：6069～6073.

14 余文景.地黄多糖、车前子多糖、淫羊藿多糖及菟丝子多糖对成体大鼠肝脏干细胞生长影响的研究.成都中医药大学，2010.

Objective To observe the kidney prescription in the serum enzyme activity of alcoholic fatty liver model rats and the effect on the liver function，to explore the protection effect of the prescription of alcoholic fatty liver. Methods 56 degrees hongxing spirit erguotou wine ig（10 ml/kg，2 times/d，for 8 weeks）method to establish the rat model with alcoholic fatty liver. After 8 weeks ， the rats model were divided into control group and treatment control group（ with Haiwangjinzun drug），kidney prescription treatment groups（prepared rhizome of rehmannia，medicinal indianmulberry root，a fairy spleen）high，medium and low dose group，respectively with（3.0g/ml）10ml/（kg·d）、（1.5g/ml）10ml/（kg·d）、（0.75g/ml）10ml/（kg·d）lavage treatment；Model control group with the same amount of distilled water，for 4 weeks in a row，at the same time establish normal control group.12 h after the treatment，fasting，liver detection index，liver portal vein blood serum detection，serum gammaglutamine transferase（γ-GT），aspertate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）activity. Results For the liver function index in the model group，gamma GT，ALT and AST activity were higher than normal control group significantly（P＜0.05），body quality was significantly lower（P＜0.05）； in the high，medium and low dose of Chinese medicine group，western medicine group liver index，γ-GT，ALT and AST activity were significantly lower in the model group（P＜0.05），body quality significantly increased（P＜0.05）. Conclusion The kidney prescription of Chinese traditional medicine can reduce γ-GT，ALT，AST，reduce the accumulation of hepatic fat，reduce the damage in liver cells，thus having protective effect on the alcoholic fatty liver.

Kidney prescriptions Alcoholic fatty liver Gamma glutamine transferase Aspertate aminotransferase Alanine aminotransferase

浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2013R410048）

310053 浙江中医药大学（朱星瑜 管斯琪 傅天啸）310053 浙江中医药大学滨江学院（刘潇 陈卓）

1.5指标检测 （1）肝脏指数：实验结束后，对各组大鼠进行称量，取血后立即采用脊柱脱臼法处死，取肝脏，测量各组大鼠肝脏质量，肝脏指数计算公式：肝脏指数 = 肝湿质量/体质量×100%。（2）血液指标：给药4周后，禁食12h（不禁水），门静脉采血6ml离心分离血清。以2500 r/min转速离心10 min，分别取上清液20μl测定γ-GT、ALT和AST 活力。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，通过重复测量方差的统计方法，将各组之间各项指标水平进行比较和对照，若方差齐则采用 LSD 检验，方差不齐则采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。