miR-21与IL-12在儿童支气管哮喘血清中的含量及意义

程诗亮　江春燕　倪美良★

miR-21与IL-12在儿童支气管哮喘血清中的含量及意义

程诗亮江春燕倪美良★

目的 检测儿童哮喘急性发作期血清miR-21与白介素12（IL-12）的水平及其在哮喘发病中的作用。方法 选取支气管哮喘儿童60例，并选取同时期60例健康儿童作为对照组，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别检测各组血清miR-21与IL-12的含量，并对哮喘患儿血清中miR-21、IL-12和肺功能的关系进行相关性分析。结果 儿童哮喘急性发作期血清中miR-21相对表达量明显高于对照组（P＜0.01），血清IL-12水平明显低于对照组（P＜0.01）。血清中miR-21在轻度、中度和重度哮喘患者中的表达水平呈逐渐上升趋势，各组间差异有统计学意义（P＜0.01）；血清中IL-12在轻度、中度和重度哮喘患者中的表达水平呈逐渐下降趋势，各组间差异有统计学意义（P＜0.01）。血清中miR-21的相对表达量与FEV1%和PEF%均呈负相关，而血清中IL-12的含量与FEV1%和PEF%均呈正相关。结论 miR-21与IL-12可作为儿童哮喘急性发作期的疾病严重性的标志物，可能参与了支气管哮喘的发病。

儿童 哮喘 microRNA 白介素12

支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，是常见的儿童慢性疾病［1］。Th1/Th2细胞亚群的失衡是支气管哮喘发生、发展的关键，Th2优势分化并大量释放Th2型细胞因子引起的嗜酸粒细胞性慢性气道炎症是哮喘特征性病理改变［2］。作者通过检测儿童支气管哮喘急性发作期血清中miR-21与白介素12（IL-12）的含量，探讨其在儿童支气管哮喘发病中的作用和临床意义。报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 选取2012年1月至2014年12月间在本院门诊或住院治疗的支气管哮喘儿童60例，其中男35例，女25例；平均年龄（9.3±2.52）岁。按照2008年的《儿童支气管哮喘防治指南》［3］支气管哮喘急性发作严重程度分级，将急性发作期支气管哮喘儿童分为轻度、中度及重度，其中轻度哮喘24例、中度22例，重度14例。同时选取相同时期在保健科进行正常体检的健康儿童60例作为健康对照组，男32例，女28例；平均年龄（8.8±1.83）岁。健康对照组儿童均无个人及家庭的哮喘病史和过敏性疾病病史。两组儿童性别、年龄等差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。标本收集获得医院伦理委员会批准，并获得儿童家长签署知情同意书。

1.2主要试剂 引物及RNA提取试剂盒均购自InVitrogen公司；miRcute miRNA试剂盒购自Tiangen公司；逆转录酶、SYBR Mastermix、RNA酶抑制剂、5Xbuffer、dNTPs等购自于Takara公司。逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）引物序列如下：miRNA-21：（forward）5'-AACCCGUAGAUCUUGGAUCCUG-3'，（reverse） 5-CAAGAUCAUCUACGGUUUGGGU-3'；内参β-Actin：（forward）5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3'，（reverse）5'-GTGGACGGGAGGAGGACTGG-3'。

1.3血清IL-12的检测 抽取各组空腹血10ml，立即低温离心（-4°，5000r/min，10min），取血清-80℃冻存，统一采用ELISA试剂盒（美国Santa Cruz公司）进行检测。

1.4血清microRNA-21的检测 在无菌无RNA酶条件下用Trizol一步法提取血清总RNA，用生物分光光度仪（日本MaIcom）测定总RNA浓度，0D260/280在1.8～2.0之间。取10ng血清总RNA和3μl逆转录酶混合，在15μl的反应体系中逆转录cDNA，反应条件：15℃30min，40℃ 30min，80℃5min，逆转录产物-80℃保存备用。取cDNA稀释150倍后，取4μl cDNA与4μl TaqMan引物混合，在20μl反应体系中进行qPCR，定量PCR条件如下：97℃变性10min，70℃退火60s，60℃延伸60s，循环40次。以公式Iog10250-Ct表示microRNA-21的相对表达情况。

1.5肺功能检测 采用德国雅格功能测试仪（MSPAED），由肺功能室专人负责患儿肺功能检测。所得主要参数为第1秒用力呼气肺活量占预计值的百分比（FEV1）和最大呼气流量占预计值的百分比（PEF），均以实测值占预计值的百分比表示。根据受试者性别、年龄、体重、身高调整测得预计值。

1.6统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间比较采用t检验，多组数据的差异显著性分析用单因素方差分析。相关性分析采用Pearman直线相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1哮喘组和对照组血清miR-21与IL-12水平 哮喘急性发作期儿童血清中miR-21相当于内参的表达为（5.16±1.15），而健康对照组中miR-21表达为（3.63±1.54），哮喘组明显高于对照组（P＜0.01）。哮喘急性发作期儿童血清IL-12水平［（32.13±13.38）ng/L］明显低于对照组儿童［（62.32±12.18）ng/L］（P＜0.01）。

2.2轻、中及重度哮喘儿童血清miR-21与IL-12水平比较 见表1。

表1　轻、中、重度哮喘患儿血清miR-21与IL-12水平比较（±s）

表1　轻、中、重度哮喘患儿血清miR-21与IL-12水平比较（±s）

注：与轻度组比较，*P＜0.05；与中度组比较，#P＜0.05

组别nmiR-21IL-12（ng/ml）轻度组244.34±1.0258.24±12.21中度组225.62±1.42*36.01±9.48*重度组146.31±2.05* #26.63±15.22*#

2.3血清中miR-21、IL-12水平与肺功能的相关性分析 哮喘儿童血清中miR-21与IL-12含量呈负相关（r=-0.531，P=0.016）。血清中miR-21的相对表达量与FEV1%和PEF%均呈负相关（r=-0.48，P=0.022；r=-0.52，P=0.007）。而血清中IL-12的含量与FEV1%和PEF%均呈正相关（r=0.42，P=0.035；r=0.65，P=0.0001）。

3　讨论

近年研究发现［4］，体内白介素12（IL-12）水平的下降与Th1/Th2细胞亚群失衡密切相关。IL-12可有效抑制Th2类细胞因子如IL-4、IL-5等的产生，从而抑制Th2型免疫应答和气道炎症反应［5］。但对于哮喘体内IL-12水平下降的上游调控机制的研究较少，尤其是基因调节层面。近年来，microRNA（miRNA）在哮喘发病过程中的作用日益引起重视。MicroRNA是一类长度为21～25个核苷酸单链小分子RNA，其主要功能是在转录后水平调控与机体生长、发育和疾病发生发展相关基因的表达。近年大量研究发现，miRNA在支气管哮喘的发病中发挥着至关重要的作用。研究发现［6］，miRNA-155在T细胞向Th1和Th2细胞分化过程中发挥着关键作用，通过敲除小鼠miRNA-155后，小鼠气道重塑增加和免疫耗竭，由此奠定了miRNA在支气管哮喘发病机制中的地位。

MiR-21与支气管哮喘发病之间的关系尚存在争议。本文证实支气管哮喘儿童血清中miR-21表达量明显增高，而血清中IL-12的水平明显降低，而且两者的血清水平具有明显相关性。由此可见，miR-21可能通过调控IL-12表达间接参与哮喘的发生。但是也有学者发现［7］，使用脂多糖刺激外周血单核细胞后miR-21表达上调，miR-21通过负性调控NF-κB和PDCD4，抑制炎症反应，可能对哮喘发病起抑制作用。因此，miR-21在哮喘中的作用及其具体机制仍需进一步研究证实。

本文首次发现，血清中miR-21和IL-12水平与支气管严重性分级和肺功能参数（FEV1%和PEF%）明显相关，分级越重、肺功能越差的患儿血清中miR-21含量越高，IL-12的含量越低。由此可见，血清中miR-21和IL-12水平可作为评估支气管哮喘儿童急性发作严重程度的血清标志物，通过下调miR-21或上调IL-12的表达可能是治疗儿童支气管哮喘潜在有效途径。

1 Ren YF， Li H， Xing XH， et al.Preliminary study on pathogenesis of bronchial asthma in children.Pediatr Res，2015，77（4）：506～510.

2 Wang J， Jin RG， Xiao L， et al.Anti-asthma effects of synthetic salidroside through regulation of Th1/Th2 balance.Chin J Nat Med，2014，12（7）：500～504.

3 中华医学会儿科学分会呼吸学组，中华儿科杂志编辑委员会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南 . 中华儿科杂志，2008，46（10）：745～753.

4 刘勇，吴峰.白介素-12治疗支气管哮喘的研究进展.国际呼吸杂志，2007，27（11）：850～853.

5 张艳丽，王秀芳，雷瑞瑞，等.哮喘、毛细支气管炎患儿外周血MDSCs、IL-10和IL-12水平及意义.西安交通大学学报（医学版），2013，34（4）：503～508.

6 Rodriguez A， Vigorito E， Clare S，et al.Requirement of bic/ microRNA-155 for normal immune function. Science，2007， 316（5824）：608～611.

7 Sheedy FJ， Palsson-McDermott E， Hennessy EJ，et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21. Nat Immunol，2010，11（2）：141～147.

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