miR-19b、miR-29c及其靶基因表达在鼻咽癌发病中的作用*

张建武，　郭　爽，　李一荣

武汉大学中南医院检验科，武汉　430071



miR-19b、miR-29c及其靶基因表达在鼻咽癌发病中的作用*

张建武，郭爽，李一荣△

武汉大学中南医院检验科，武汉430071

目的探讨miR-19b、miR-29c及其靶基因表达在鼻咽癌发病中的作用。方法选择2012年7月至2015年7月武汉大学中南医院收治的70例鼻咽癌患者作为鼻咽癌组，57例慢性鼻咽炎患者作为鼻咽炎组，另选择同期在医院体检的健康人群40例作为对照组，抽取3组血液样本，采用荧光定量PCR检测3组血清miR-19b、miR-29c表达；收集鼻咽癌组、鼻咽炎组组织样本，采用Western blot检测靶基因SOCS-1、COL1A-1蛋白表达水平。结果以β-actin作为内参照，鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c相对表达量分别为(374.91±14.16)和(6.84±0.27)，鼻咽炎组分别为(171.53±7.82)和(2.14±0.07)，对照组分别为(168.95±8.05)和(2.08±0.05)，鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c相对表达量显著高于鼻咽炎组和对照组(均P<0.05)，鼻咽炎组和对照组miR-19b、miR-29c表达量比较差异无统计学意义(均P>0.05)。Western blot检测结果显示，鼻咽癌组SOCS-1蛋白表达显著低于鼻咽炎组(P<0.05)，鼻咽炎组与鼻咽癌组COL1A-1蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示，血清miR-19b与SOCS-1呈负相关关系(r=-0.573，P<0.01)；miR-29c与COL1A-1无相关性(r=0.148，P=0.291)。结论鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c表达显著升高，可以作为鼻咽癌诊断的潜在标志物；miR-19b可能通过调节靶基因SOCS-1参与了鼻咽癌的发生。

鼻咽癌；微小RNA；靶基因；相关性；分子通路

微小RNA(micro RNA，miRNA)是广泛存在于动植物体内的一种非编码RNA，只有经过剪切、加工的miRNA才能表达出相应的生物学功能[1-2]。Gadducci等[3]报道称miRNA主要参与30%以上人类蛋白编码基因，并与肿瘤的发生、发展有密切的关系。miRNA既受到表观遗传的控制，也是一种调控因子调节下游靶基因的表达。Paulsen等[4]称miRNA能够通过甲基化过程诱导沉默表达的抑癌基因再次表达，从而介导肿瘤生长的调控。由于miRNA在血液中表达相对稳定，因此更适用于作为肿瘤分子标志物。EB病毒感染是鼻咽癌发病的主要诱因，由于EB病毒属于编码miRNA的病毒，因此检测相应的miRNA表达水平会有助于鼻咽癌的诊断及预后评估[5]。本研究检测鼻咽癌患者血清miR-19b、miR-29c和组织靶基因细胞因子信号负调控因子-1(suppressors cytokine sigmaling，SOCS-1)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1 A1，COL1A-1)表达水平，旨在探讨miR-19b、miR-29c分子信号通路对鼻咽癌发病的作用，现将研究结果总结如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

本研究经中南医院伦理委员会批准，选择2012年7月至2015年7月武汉大学中南医院收治的70例鼻咽癌患者作为鼻咽癌组，同期医院收治的57例慢性鼻咽炎患者作为鼻咽炎组，鼻咽癌组男38例，女32例，年龄21～78岁，平均(57.1±6.8)岁，按照分化程度分为低分化肿瘤18例，中分化肿瘤29例，高分化肿瘤23例；按照美国癌症联合委员会[6](American Joint Committee on Cancer，AJCC)鼻咽癌临床分期标准分为Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期25例，Ⅳ期10例。鼻咽炎组男31例，女26例，年龄19～81岁，平均(56.9±6.4)岁。纳入标准：①所有患者均经病理学证实，病理活检时保留患者组织标本；②入组前未进行放疗、化疗及手术治疗；③告知患者及家属研究方案，并签署知情同意书。排除标准：①合并远处转移者；②经抗癌治疗后复发者。另选择同期在医院体检的健康人群作为对照组，男19例，女21例，年龄18～76岁，平均(57.0±6.2)岁，对照组均排除鼻咽病变、恶性肿瘤者，三组受试对象性别、年龄比较差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2主要仪器与试剂

RNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，SOCS-1、COL1A-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司，美国ABI GeneAmp 9700 PCR仪。

1.3方法

1.3.1血清miR-19b、miR-29c表达量检测采用荧光定量PCR检测3组血清miR-19b、miR-29c表达[7]：抽取3组受试对象肘静脉血3 mL，800 g离心10 min，吸取上清液置于EP管中，―80℃冰箱保存待检。按照RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA，并逆转录成cDNA。miR-19b扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸1 min，40个循环后72℃ 5 min；miR-29c扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环后72℃ 5 min。记录检测指标的Ct值，每组测量3次，取平均值，以β-actin为内参，计算miR-19b、miR-29c相对表达量(2―ΔΔCt)。

1.3.2靶基因SOCS-1、COL1A-1蛋白表达检测采用Western blot检测SOCS-1、COL1A-1蛋白表达水平：将样本充分研磨后加入蛋白裂解液(199 μL RAPI+1 μL PMSF)冰上充分裂解30 min，4℃、1 400 g离心10 min，留取上清液，置于―80℃冰箱保存待检。配置好上样缓冲液，沸水中变性5 min，冰浴5 min；SDS-PAGE电泳分离蛋白，将电泳段转移至PVDF膜上，电转后将PVDF膜取出。5%脱脂牛奶封闭2 h，PBS冲洗3次，分别加入兔抗人SOCS-1多克隆抗体和羊抗人COL1A-1多克隆抗体，室温孵育1 h，4℃过夜；PBS冲洗3次；再分别加入荧光标记的羊抗兔IgG(二抗)，室温下振摇1 h，PBS冲洗3次。荧光图像扫描及条带灰度值分析，目的蛋白相对表对量为样本条带与GAPDH条带灰度值之比。

1.4统计学方法

2　结果

2.1血清miR-19b、miR-29c扩增产物的验证

对目的基因扩增产物进行验证，结果显示内参照β-actin长度约为100 bp，目的基因miR-19b、miR-29c扩增长度约为54 bp，与文献报道[8]结论相符，且电泳带中无明显杂带，证实提取RNA无污染，目的基因符合要求，见图1。

M：Marker，1：β-actin，2：miR-19b，3：miR-29c图1　血清miR-19b、miR-29c扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of serum miR-19b and miR-29c

2.23组受试对象血清miR-19b、miR-29c表达量

以β-actin作为内参照，鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c相对表达量分别为(374.91±14.16)和(6.84±0.27)，鼻咽炎组分别为(171.53±7.82)和(2.14±0.07)，对照组分别为(168.95±8.05)和(2.08±0.05)，鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c相对表达量显著高于鼻咽炎组和对照组(均P<0.05)，

鼻咽炎组和对照组miR-19b、miR-29c表达量比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图2。

2.3SOCS-1、COL1A-1蛋白表达结果

Western blot检查结果显示，鼻咽癌组SOCS-1蛋白表达显著低于鼻咽炎组(P<0.05)，鼻咽炎组与鼻咽癌组COL1A-1蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

与鼻咽癌组比较，*P<0.05图2　3组受试对象血清miR-19b、miR-29c相对表达量Fig.2 Relative expression levels of miR-19b and miR-29c in three groups

1、2、3、4：鼻咽炎组，5、6、7、8：鼻咽癌组图3　鼻咽癌组、鼻咽炎组SOCS-1、COL1A-1蛋白表达结果Fig.3 Protein expression levels of SOCS-1 and COL1A-1 in nasopharyngeal carcinoma group and nasopharyngitis group

2.4相关性分析

相关性分析显示，血清miR-19b与SOCS-1表达呈负相关关系((r=―0.573，P=0.000)；miR-29c与COL1A-1表达无相关性(r=0.148，P=0.291)。

3　讨论

鼻咽癌是与EB病毒感染有关的一种恶性肿瘤，其发病率具有明显区域性。在我国，广东、广西和福建地区发病率较高[8-9]。鼻咽癌治疗的关键在于早期诊断，临床调查[10]显示Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌患者5年生存率约为80%～85%，而Ⅲ～Ⅳ期患者5年生存率降低至50%～60%。鼻咽部解剖结构较为特殊，且早期发病隐匿，给临床诊疗带来一定困难。EB病毒检测是鼻咽癌筛查的方法之一[11]，然而其他如乳腺癌、胃癌发病也与EB病毒感染有关，对于检测EB病毒阳性患者不能排除其他恶性肿瘤的可能。李璐等[12]也报道称约30%鼻咽癌患者EB患者检测阴性，因此单纯血清EB病毒检查亦存在一定假阴性的风险。微小RNA(miRNA)是近年来研究较多的一类RNA，国外研究[13]证实，正常人体内miRNA表达基本一致，然而对于恶性肿瘤患者，miRNA表达却呈现明显差异。Jagdis等[14]报道称血液中miRNA主要来源于肿瘤组织，与其他生物标记物相比，血miRNA检测属于无创操作，即使对于发病较为隐蔽的部位也可以及时诊断。此外，血miRNA具有抗酸、抗碱等特点，其稳定性较好，是一种理想的肿瘤分子标志物。

miR-19b、miR-29c是鼻咽癌研究较多的2种miRNA，潜伏膜蛋白l(LMP1)是EB病毒主要编码蛋白[15]，在LMP1表达阳性的鼻咽癌细胞株中，miR-19b显著升高，提示miR-19b可能参与了LMP1表达过程，导致EB病毒感染，最终发展成鼻咽癌。miR-19b属于miR-17-92家族成员之一，在细胞的增殖、分化方面发挥着重要作用。张潍等[16]研究称非小细胞肺癌患者miR-19b表达显著升高，并激活白细胞介素-6(IL-6)信号途径参与肿瘤细胞的调节。SOCS通过参与多种细胞因子的信号转导途径，调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡等生物学行为。有研究[17]证实SOCS-1是miR-19b的主要靶基因，当miR-19b表达上调后，会作用于SOCS-1的JAK/STAT通路，并通过抑制负反馈调节机制干扰肿瘤细胞凋亡等过程。本研究显示鼻咽癌组血清miR-19b表达显著高于鼻咽炎组和对照组，提示在鼻咽癌中，miR-19b表达上调，并启动相应的分子信号通路诱导细胞的增殖。为了验证miR-19b的信号通路，本研究对SOCS-1蛋白表达进行分析，结果显示鼻咽癌组SOCS-1蛋白表达显著低于鼻咽炎组，提示miR-19b高表达会抑制靶基因SOCS-1的表达，使JAK/STAT通路受阻，使肿瘤细胞“逃离”JAK/STAT通路的监测。相关性分析也证实血清miR-19b与SOCS-1呈负相关关系，说明miR-19b是鼻咽癌发病的一个主要诱因之一，血清miR-19b检测也可以作为鼻咽癌诊断的潜在分子标志物。王晨等[18]也报道称miR-19b与SOCS-1 mRNA可以相互抑制对方的翻译过程，影响STAT通路导致肿瘤细胞增殖，促进鼻咽癌的发生、发展。

miR-29c属于miR-29家族成员，马筱秋等[19]采用基因芯片检测技术发现miR-29c在胃癌患者中表达水平显著升高。关于miR-29c作用机制目前研究很少，有报道[20]称miR-29c过表达会改变细胞外基质蛋白的行为，导致细胞侵袭能力显著增强。Bae等[21]也证实miR-29c能够降低层黏连蛋白、基质金属蛋白和胶原蛋白的表达，导致肿瘤细胞发生迁移、侵袭。COL1A-1属于Ⅰ型胶原蛋白，被认为是miR-29c靶基因之一[22]。本研究对miR-29c、COL1A-1表达进行检测，结果显示鼻咽癌组血清miR-29c表达显著高于鼻咽炎组和对照组，然而鼻咽炎组与鼻咽癌组COL1A-1蛋白表达比较差异无统计学意义，提示miR-29c与靶基因COL1A-1分子通路可能不是鼻咽癌发病机制，相关性分析也显示miR-29c与COL1A-1无相关性。当然机体内细胞因子、靶基因的调控机制错综复杂，也不能排除其他因素参与了调节过程，因此这一信号通路对鼻咽癌诊疗是否有价值依然需要进一步证实。

综上所述，鼻咽癌组血清miR-19b、miR-29c表达显著升高，可以作为鼻咽癌诊断的潜在标志物；miR-19b可能通过调节靶基因SOCS-1参与了鼻咽癌的发生。

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(2016-04-30收稿)

Role of miR-19b，miR-29c and Their Target Genes in Nasopharyngeal Carcinoma

Zhang Jianwu，Guo Shuang，Li Yirong△

MedicalLaboratoryofZhongnanHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430071，China

ObjectiveTo explore the role of miR-19b，miR-29c and their target genes in the development of nasopharyngeal carcinoma.MethodsA total of 70 nasopharyngeal carcinoma patients treated in Zhongnan Hospital of Wuhan University from July 2012 to July 2015 were selected as nasopharyngeal carcinoma group，57 patients with chronic nasopharyngitis as nasopharyngitis group，and another 40 healthy individuals as control group.Blood samples were collected from the three groups.The expression of miR-19b and miR-29c was detected by real-time quantitative PCR in the three groups.The expression levels of target genes SOCS-1 and COL1A-1 protein were detected by Western blotting in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis tissues.ResultsWith β-actin as an internal reference，the relative expression levels of miR-19b and miR-29c were(374.91±14.16)and(6.84±0.27)in nasopharyngeal carcinoma group，(171.53±7.82)and(2.14±0.07)in nasopharyngitis group，and(168.95±8.05)and(2.08±0.05)in control group.They were significantly increased in nasopharyngeal carcinoma group as compared with those in nasopharyngitis group and control group(P<0.05 for all).There was no significant difference in the expression of miR-19b and miR-29c between nasopharyngitis group and control group(P>0.05).Western blotting showed that the expression of SOCS-1 was much lower in nasopharyngeal carcinoma group than that in nasopharyngitis group(P<0.05).There was no significant difference in the expression of COL1A-1 protein between the nasopharyngeal carcinoma group and the nasopharyngitis group(P>0.05).Correlation analysis showed that serum miR-19b was negatively correlated with SOCS-1(r=-0.573，P<0.01)，and miR-29c had no correlation with COL1A-1(r=0.148，P=0.291).ConclusionThe levels of serum miR-19b and miR-29c were significantly increased in patients with nasopharyngeal carcinoma，which suggested that serum miR-19b and miR-29c may be used as a potential marker for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.miR-19b may be involved in the occurrence of nasopharyngeal carcinoma by regulating the target gene SOCS-1.

nasopharyngeal carcinoma；micro RNA；target gene；correlation；molecular pathway

，Corresponding author，E-mail:liyirong838@163.com

R739.6

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.018

*国家自然科学基金资助项目(No.81371779)

张建武，男，1970年生，主管检验师，E-mail:zangjw13579@163.com