吲哚胺2，3-双加氧酶在创伤后应激障碍大鼠海马中的表达变化与作用*

段发亮，　王孟阳，　吴京雷，　罗　明，　韦君武，　杨国平，　何主强

华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院，武汉市第一医院神经外科，武汉　430022



吲哚胺2，3-双加氧酶在创伤后应激障碍大鼠海马中的表达变化与作用*

段发亮，王孟阳，吴京雷，罗明，韦君武，杨国平，何主强△

华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院，武汉市第一医院神经外科，武汉430022

目的通过检测创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)大鼠海马中吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)含量变化与运用IDO抑制剂治疗对神经元细胞的保护机制，探讨PTSD发病原因及机制。方法将60只健康雄性Wistar大鼠随机分为：对照组、PTSD组、PTSD+IDO抑制剂治疗组，运用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量变化，通过RT-PCR、Western blot检测IDO的表达情况。通过TUNEL染色法检测海马神经元凋亡率，并对大鼠进行行为学评估。结果检测结果显示对照组、PTSD组与IDO抑制剂治疗组TNF-α分别为[(1.26±0.12)vs. (8.58±0.67)vs. (3.69±0.41)pg/mL]、IL-6分别为[(2.28±0.19)vs. (15.72±1.42)vs. (7.45±0.58)pg/mL]、IDOmRNA分别为[(0.152 7±0.014 7)vs. (0.827 8±0.079 6)vs. (0.223 6±0.038 7)]、IDO蛋白分别为[(0.061 2±0.008 6)vs. (1.232 9±0.114 8)vs. (0.423 5±0.041 1)]、神经元的凋亡率为[(5.46±1.87)%vs. (81.47±6.86)%vs. (42.54±3.98)%](均P<0.05)，行为学表现明显改善。结论PTSD大鼠海马区域TNF-α、IL-6、IDO表达显著提高，IDO抑制剂治疗能降低其含量，细胞因子、IDO在PTSD发病机制中起重要作用，运用IDO抑制剂能改善PTSD大鼠海马区域神经元损伤。

创伤后应激障碍；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6；吲哚胺2，3-双加氧酶

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)为机体对突发自然灾害、战争、严重交通意外、恐怖袭击、外伤、虐待等强烈外界刺激的一种异常精神反应，是应激性精神障碍中最为典型的一种[1-2]。临床表现具有病程长、治疗效果不明显的特点，近年来PTSD发病率逐渐升高[3-4]。实验表明[5]PTSD是在剧烈环境刺激下，由个体生物易感基因及相关蛋白相互作用所致，PTSD发病机制目前尚不清楚，强烈的外界刺激可过度激活免疫系统，外周免疫系统通过巨噬细胞释放前炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)触发与应激相关神经内分泌、神经生理生化与行为学改变。研究证实[6-8]吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)为色氨酸-犬尿氨酸代谢路径上最重要的限速酶，调节神经递质5-羟色胺代谢，均主要表达在外周巨噬细胞与中枢小胶质细胞上。本研究主要检测PTSD大鼠海马区域TNF-α、IL-6、IDO含量变化，以及运用IDO抑制剂治疗对神经元功能的保护作用及行为学的改善情况，探索细胞因子、IDO在PTSD发病过程中的相互作用机制，为临床开发PTSD新的治疗途径提供依据。

1　材料与方法

1.1动物分组

健康雄性成年Wistar大鼠60只(体重为120～160 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)，首先在实验室进行适应性饲养7 d，然后随机分为3组：对照组、PTSD组、IDO抑制剂治疗组，采取国际上公认的单次延长应激(single-prolonged stress，SPS)建立PTSD组与IDO抑制剂治疗组动物模型。模型建立后给予对照组及PTSD组大鼠鼻饲生理盐水，IDO抑制剂治疗组给予鼻饲二唑基-N-羟基苯甲脒10 mg/(kg·d)，14 d后进行指标检测，实验步骤均经过动物伦理学审核，并严格遵守美国卫生研究所(NIH)颁布的实验动物标准。

1.2行为学检测

在行为学实验室用遮光布隔断室外光线，室内用4个60 W白炽灯安放于实验室4角，照射于墙壁上获得漫反射光源，照度120～280 lx，照度恒定。室温在21～24℃之间，注意实验室通风及保持安静。并配备红外摄像仪，依次进行旷场实验(openfield test，OF test)评估大鼠的自发活动能力，高架十字迷宫实验(elevated plus mace，EPM)评估大鼠的焦虑水平和水迷宫实验(Morris water mace，MWW)评估大鼠的空间学习和记忆能力。

1.3RT-PCR测定海马区域IDO mRNA含量变化

采用Trizol试剂盒一步法提取海马组织总RNA，按RT试剂盒逆转录获得cDNA，取25 μL反应体系，上机(Applied Biosystems)行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，2 min变性。之后95℃，15 s退火；58℃，60 s；72℃，30 s进行40个循环。然后72℃，10 min延伸。Primer Premier 6.0软件设计IDO引物：IDO上游引物5′-GCGCTGTTGGAA-ATAGCTTC-3′，下游引物5′-CAGGACGTCA-AAGCACTGAA-3′，分子量192 bp；β-actin上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，分子量204 bp。对扩增产物进行定量检测，结果为IDO /β-actin灰度比值。

1.4Western blot测定海马区域IDO蛋白含量变化

将海马组织置入研磨器中，加入裂解液，常规提取总蛋白，按BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。然后制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶，电泳，转膜，以小牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入一抗稀释液(1∶500)，然后在40℃条件下孵育过夜。用二抗稀释液(羊抗鼠二抗1∶200)，常温孵育1 h。用ECL显影液进行显色，凝胶成像系统进行胶片的曝光、成像。IDO分子量为42 kD。检测结果为IDO /β-actin灰度比值。

1.5检测大鼠海马区域神经元细胞凋亡率

消毒后开颅取脑，分离海马组织，石蜡包埋切片。根据TUNEL试剂盒操作说明书进行染色，运用HMIAS-2000系统对每组大鼠海马切片进行TUNEL染色后计数凋亡神经细胞，随机选取非重叠的5个高倍镜视野进行计数，取其均值，凋亡率=凋亡细胞数/神经元细胞总数× 100%。

1.6大鼠海马区IL-6，TNF-α含量检测

采用夹心酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，对海马组织标本按试剂盒上的操作步骤进行检测。

1.7统计学处理

2　结果

2.1各组大鼠行为学评估结果

旷场行为(水平活动距离、中央停留时间)是评定实验动物的警觉水平、焦虑状态和环境适应能力的方法。高架十字迷宫(开臂进入次数的百分比、开臂停留时间百分比)是运用大鼠对未知环境的探究性，及对高悬开臂的恐惧感形成的矛盾冲突状态来评测实验动物焦虑素质特征。Morris水迷宫实验(上台潜伏期)通过检测动物空间学习及记忆能力，评定动物空间认知功能加工过程，了解应激刺激对动物认知功能的影响。实验结果表明：与对照组相比，PTSD组大鼠水平活动距离(8 775.84±38.67)mm、中央停留时间(22.65± 1.54)s明显减少，开臂进入次数的百分比(21.49±2.98)%、开臂停留时间百分比(10.55±1.96)%明显降低以及上台潜伏期(56.38 ±4.21)s明显延长(均P<0.05)；与PTSD组相比，IDO抑制剂治疗组大鼠水平活动距离(5 668.45±28.79)mm、中央停留时间(30.78±3.20)s明显增加，开臂进入次数的百分比(29.87±4.02)%、开臂停留时间百分比(13.89±2.75)%显著提高以及上台潜伏期(49.27±2.78)s缩短，均P<0.05。

2.2各组大鼠海马区中IDO mRNA含量的变化

对照组大鼠海马区域IDO mRNA转录水平较低，PTSD组IDO mRNA转录水平明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。PTSD组大鼠给予IDO抑制剂治疗后，IDO转录水平降低，与PTSD组间相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

M：Marker；1：对照组；2：PTSD组；3：PTSD+IDO抑制剂治疗组；4：对照组内参；5：PTSD组内参；6：PTSD+IDO抑制剂治疗组内参图1　RT-PCR检测IDO mRNA表达Fig.1 RT-PCR for the detection of the expression of IDO mRNA

2.3各组大鼠海马区中IDO蛋白含量的变化

对照组海马组织中IDO在蛋白水平表达较低，PTSD组大鼠海马组织中IDO蛋白含量显著升高(均P<0.05)。而IDO抑制剂治疗组，IDO蛋白含量减少，与PTSD组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2，表1。

1：对照组；2：PTSD组；3：PTSD+IDO抑制剂治疗组图2　Western blot检测大鼠海马组织中IDO蛋白表达Fig.2 Western blot analysis of the expression of IDO protein in the hippocampus of rats

2.4各组大鼠海马区神经元细胞凋亡情况

对照组海马区仅可见少量TUNEL染色阳性细胞，PTSD组海马区可见较多TUNEL染色阳性细胞。IDO抑制剂治疗组海马区TUNEL染色阳性细胞较PTSD组显著降低，统计数据表明，IDO抑制剂治疗组、PTSD组与对照组3组间比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)(图3，表1)。

A：对照组;B：PTSD组;C：IDO抑制剂治疗组图3　大鼠海马区神经元细胞凋亡情况比较(TUNEL染色，×400)Fig.3 Comparison of the neuron apoptosis in rat hippocampus(TUNEL staining，×400)

2.5各组大鼠海马区炎性因子TNF-α和IL-6表达情况

大鼠海马区域炎性因子水平检测数据表明，PTSD组大鼠海马组织TNF-α、IL-6较对照组显著提高，差异有统计学意义(均P<0.05)；IDO抑制剂治疗组比对照组升高(均P<0.05)，但与PTSD组比较明显降低(均P<0.05)，各组间差异均有统计学意义(表1)。

表1　各组间细胞因子、IDO含量及凋亡率比较

与对照组比较，*P<0.05；与PTSD组比较，△P<0.05

3　讨论

虽然PTSD病因尚未明确，但IDO被认为是PTSD多种病理机制假说中的共同调节因子，在PTSD的发病中具有重要作用。下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴、神经递质(如5-羟色胺，5-HT)主要参与机体对应激反应、情绪及觉醒的维持。过度的机体应激使HPA轴兴奋，促使细胞因子异常分泌。而跨膜蛋白可将前炎性因子(如：TNF-α、IL-6)通过主动转运到脑组织，触发中枢神经系统后续的免疫应答。PTSD病变基础主要为炎性因子及压力相关蛋白的异常表达，神经递质下降及行为学改变[9]。本研究中PTSD鼠中枢TNF-α、IL-6含量升高，而应用IDO抑制剂后TNF-α、IL-6表达下降，表明IDO与细胞因子可相互调节，应激可激活机体免疫系统失衡，分泌过量的炎性细胞因子及上调压力相关性蛋白表达，引起PTSD行为学改变。

实验证明[10-11]在抑郁症患者中有COX-2的表达异常，强烈的应激刺激可激活免疫系统释放前炎性细胞因子，过量的炎性细胞因子引发颅内继发性损伤，PTSD主要病理学改变为5-HT神经递质含量下降，在多种急慢性神经退行性疾病中均有IDO的异常表达，它是调节脑内神经递质的最终限速酶。目前PTSD患者的药物治疗手段仍十分有限，通过美国食品药品管理局(FDA)批准的只有5-羟色胺重摄取抑制剂帕罗西汀及舍曲林，但治疗效果并不理想。本研究通过SPS法建立PTSD模型测得大鼠海马区IDO含量明显升高，运用IDO抑制剂治疗后大鼠焦虑症状得到明显改善，与正常对照组相比差异有统计学意义，提示PTSD大鼠的焦虑情绪反应可以通过二唑基-N-羟基苯甲脒的治疗而得到缓解。同时也证明IDO的表达升高主要参与了创伤后应激障碍的发病过程，且可以作为药物治疗创伤后应激障碍的潜在靶点。IDO蛋白的表达与机体内发生的炎症反应密切相关，研究也证实促炎性因子的升高伴有IDO含量的增加，进而引起PGE2、NO及氧化应激产物的表达上调[12-13]。氧化应激在细胞凋亡中的机制已被证实，IDO通过正反馈机制使细胞因子进一步升高，以上均加重了神经元细胞的不可逆损伤。

综上所述，细胞因子、IDO可能在PTSD发病机制中扮演重要的角色。本实验表明应激状态下TNF-α、IL-6、IDO在PTSD大鼠海马区域表达明显升高，这与PTSD的病理改变及影像学检测显示的脑结构和功能异常的脑区非常一致[14-15]。PTSD大鼠海马区的炎性因子增加和IDO表达上调共同参与了中枢神经损伤。早期给予选择性IDO抑制剂(新型二唑基-N-羟基苯甲脒)可降低海马区细胞因子、IDO水平，提高中枢神经系统神经递质5-HT含量，改善行为学变化。这对PTSD临床早期干预和开发新的治疗手段具有重要意义。我们认为可以把二唑基-N-羟基苯甲脒作为PTSD新的治疗手段进一步研究与开发。

[1]殷莉，黄姗姗，何主强.吲哚胺2，3-双加氧酶及细胞因子在创伤后应激障碍患者中的表达变化及意义[J].华中科技大学学报：医学版，2016，45(1)：108-110.

[2]Josh M C，Keith B G，Andrew J，et al.Decoding the traumatic memory among women with PTSD：Implications for neurocircuitry models of PTSD and real-time fMRI neurofeedback[J].PLoS One，2015，10(4)：1-17.

[3]Pietrzak R H，Goldstein R B，Southwick S M，et al.Psychiatric comorbidity of full and partial post-traumatic stress disorder among older adults in the United States：results from wave 2 of the National Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions[J].Am J Geriatr Psychiatry，2012，20(5)：380-390.

[4]Cohen H，Kaplan Z，Koresh O，et al.Early post-stressor intervention with propranolol is ineffective in preventing post-traumatic stress responses in an animal model for PTSD[J].Eur Neuropsychopharmacol，2011，21(3)：230-240.

[5]Thomas C，Eric E，Rachel Y.Biomarkers for combat-related PTSD：focus on molecular networks from high-dimensional data[J].Eur J Psychotraumatol，2014，5(7)：1-3.

[6]Moeller D R，Duffy J M，Goolsby A M，et al.Use of a removable mandibular neuroprosthesis for the reduction of post-traumatic stress disorder(PTSD)and mild traumatic brain injury/PTSD/associated nightmares，headaches，and sleep disturbances[J].Spec Oper Med，2014，14(3)：64-73.

[7]Koek R J，Langevin J P，Krahl S E，et al.Deep brain stimulation of the basolateral amygdala for treatment-refractory combat post-traumatic stress disorder(PTSD)：study protocol for a pilot randomized controlled trial with blinded，staggered onset of stimulation[J].Trials，2014，15(5)：356-358.

[8]Kousha M，Mehdizadeh T S.Normative life events and PTSD in children：how easy stress can affect children’s brain[J].Acta Med Iran，2013，51(1)：47-51.

[9]Richard R.A molecular clue to PTSD[J].PloS Biology，2015，13(2)：1-2.

[10]Gao H M，Liu B，Zhang W et al.Novel anti-inflamatory therapy for Parkinson's disease[J].Trends Pharmacol Sci，2003，24(6)：395-401.

[11]Hinz B，Brune K.Paracetamol and cyclooxygenase inhibition：is there a cause for concern?[J].Ann Rheum Dis，2012，71(1)：20-25.

[12]Said R S，Badr A M，Nada A S，et al.Sodium selenite treatment restores long-lasting ovarian damage induced by irradiation in rats：impact on oxidative stress and apoptosis[J].Reprod Toxicol，2014，43(5)：85-93.

[13]Nury T，Zarrouk A，Vejux A，et al.Induction of oxiapoptophagy，a mixed mode of cell death associated with oxidative stress，apoptosis and autophagy，on 7-ketocholesterol-treated 158N murine oligodendrocytes：impairment by α-tocopherol[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，446(3)：714-719.

[14]张建芳，陈欣，王伟，等.异氟烷通过激活Calpain影响大鼠海马神经干细胞的增殖与分化[J].华中科技大学学报：医学版，2015，44(3)：263-267.

[15]Puetz T W，Youngstedt S D，Herring M P.Effects of pharmacotherapy on combat-related PTSD，anxiety，and depression：a systematic review and meta-regression analysis[J].PloS One，2015，10(5)：529-532.

(2016-02-25收稿)

Changes of the Expression of Indoleamine 2，3-dioxygenase in the Hippocampus of Rats with Post-traumatic Stress Disorder

Duan Faliang，Wang Mengyang，Wu Jingleietal

DepartmentofNeurosurgery，WuhanFirstHospital，AffiliatedTCM-integratedHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the changes of the expression of indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)in the hippocampus of rats with post-traumatic stress disorder(PTSD)and the protective effect of the IDO inhibitor on neurons，in an attempt to explore the pathogenesis of PTSD.MethodsAdult male Wistar rats were randomly divided into three groups：control group，PTSD group，and PTSD+IDO inhibitor group(n=20 each).The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)were detected by ELISA and the expression of IDO by RT-PCR and Western blotting.TUNEL staining was used to observe the apoptosis of rat hippocampal neurons.Rat behaviors were also evaluated.ResultsThe levels of TNF-α were(1.26±0.12)，(8.58±0.67)，and (3.69±0.41)pg/mL in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The levels of IL-6 were(2.28±0.19)，(15.72±1.42) and (7.45±0.58)pg/mL in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The expression of IDO was(0.1527±0.0147)，(0.8278±0.0796) and (0.2236±0.0387)at mRNA level and(0.0612±0.0086)，(1.2329±0.1148)，(0.4235±0.0411)at protein level in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).The apoptosis rates were(5.46±1.87)%，(81.47±6.86)% and (42.54±3.98)% in control，PTSD and PTSD+IDO groups，respectively(P<0.05).Rat behavioral function was significantly improved in PTSD+IDO group.ConclusionThe expression levels of TNF-α，IL-6 and IDO were significantly increased in the hippocampus of PTSD rats，which could be reversed by the IDO inhibitor.The IDO inhibitor could improve the neuron injuries in the hippocampus of PTSD rats.

post-traumatic stress disorder；tumor necrosis factor-α；interleukin-6；indoleamine 2，3-dioxygenase

，Corresponding author，E-mail：colei@sina.com

R329.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.006

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2015CFB694)，武汉市卫生计生委科研项目(No.WZ16C10)

段发亮，男，1973年生，副主任医师，医学博士，E-mail：Duanfaliang@126.com