老年大鼠创伤性脑损伤后血管再生调节因子表达与肠黏膜、肠屏障功能的变化

钱春生，　张　斌，　钱腾达，　何云文，　李益欢，　董吉荣

1江苏大学附属金坛医院神经外科，常州　2132002中国人民解放军101医院，无锡　214000



老年大鼠创伤性脑损伤后血管再生调节因子表达与肠黏膜、肠屏障功能的变化

钱春生1，张斌1，钱腾达1，何云文1，李益欢1，董吉荣2

1江苏大学附属金坛医院神经外科，常州2132002中国人民解放军101医院，无锡214000

目的观察老年大鼠创伤性脑损伤后血管再生调节因子表达与肠黏膜、肠屏障功能的变化。方法选择体重为500～600 g，17～20个月月龄的健康老年雄性SD大鼠，制备老年大鼠创伤性脑损伤模型，按损伤时间分为伤后3、12、24、72 h和5 d，假手术组为对照组，每组10只。记录和比较各组大鼠行为学、脑组织含水量、肠黏膜显微特征、肠屏障功能和脑组织中VEGF和CD34蛋白表达。结果与对照组比较，创伤性颅脑损伤3 h～5 d，随着损伤时间的延长，大鼠的行为学评分、脑组织含水量、脑组织中VEGF和CD34蛋白表达均明显增高(均P<0.05)，肠绒毛高度、绒毛中段直径、隐窝深度和绒毛表面积均明显降低(均P<0.05)；肠黏膜绒毛的破坏度明显，绒毛间质疏松，肠绒毛排列不规则甚至断裂，绒毛上皮坏死脱落，变矮，间距增宽，固有层出现不同程度水肿，上述异常在伤后24～72 h达到高峰(均P<0.05)。结论密切关注老年大鼠创伤性脑损伤后24～72 h的病情转归对降低病残和致死率应有积极意义，增高VEGF和CD34表达，促进血管再生可能是治疗创伤性脑损伤后继发性脑损害的新思路。

老年大鼠；创伤性脑损伤；血管再生调节因子；肠黏膜；肠屏障功能

导致创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)相关的致残或致死与创伤性颅脑损伤后肠道功能改变有关，因为肠道功能改变可导致多器官功能衰竭(multiple-organ pathology，MOF)，这一点在老年创伤性颅脑损伤患者表现得尤为明显。美国每年创伤性颅脑损伤的人数超过170万，死亡率超过2‰，死亡人数中老年人超过半数[1-2]。但肠道功能改变导致MOF或死亡的机制尚不明确。现有的研究显示创伤性脑损伤后血管再生可减轻或修复继发性脑损伤，有助于挽救神经元和恢复脑缺血区血供，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和分化簇抗原34(cluster of differentiation 34，CD34)蛋白是2种研究较为成熟的血管再生调节因子[3-4]。因此本课题拟制备老年大鼠创伤性脑损伤模型，分析肠道功能改变特征及VEGF和CD34蛋白的变化，为研究和治疗老年创伤性脑损伤提供参考。

1　材料和方法

1.1受试动物

选择体重为500～600 g，17～20个月月龄的健康老年雄性SD大鼠。动物来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2008-0016，昼夜节律饲养，自由饮食饮水，实验室内适应饲养1周后再进行试验。

1.2试剂与仪器

兔抗鼠CD34一抗，兔抗鼠单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒和抗原修复液均由武汉博士德生物公司提供，DAB显色试剂盒由福建迈新生物技术有限公司提供，甲醛、二甲苯、乙醇、PBS和苏木精等均由常州市纬凯化工化学试剂有限公司提供。奥林巴斯显微镜、奥林巴斯电子显微镜为日本奥林巴斯公司产品，EG1150 C包埋机为德国LEICA公司产品，微量电子天平为瑞士仪器公司产品。

1.3实验方法

1.3.1老年大鼠创伤性脑损伤模型的制备采用Feeney方法制作大鼠创伤性脑损伤模型。老年大鼠全麻后，将头部固定在立体定向仪上，沿正中线切开头皮剥离骨膜，在前囟后3.5 mm和中线右旁2.5 mm处钻开直径约5 mm的圆形骨窗，采用撞击器的撞杆头端置于骨窗处，40 g重量击锤外周套管自由落下15 cm冲撞杆，采用牙托粉封闭骨窗并缝合头皮。

1.3.2分组将老年大鼠创伤性脑损伤模型按损伤时间分为伤后3、12、24、72 h和5 d组，将仅切开头皮，不进行自由落体打击处理的大鼠作为对照组，每组10只。

1.3.3指标检测①动物行为学观察：从大鼠的运动(1～6分)、感觉(0～2分)、平衡(0～6分)和反射能力(0～4分)对行为学评价，总分为18分，分数越低则脑损伤程度越轻。轻度：1～6分，中度：7～12分，重度：13～18分。②脑组织含水量：分别于各组时间点处死大鼠，每组取5例，迅速剥离大脑，吸去表面血迹及液体并称重，放入恒温干燥箱100℃，至恒重，记录干重，计算每只大鼠的脑组织含水量(%)。③肠黏膜：取各组大鼠的小肠肠黏膜，采用甲醛固定，HE染色，显微镜下观察。④肠屏障功能指标：取空肠3 cm，在光镜下记录空肠肠绒毛高度、绒毛中段直径和隐窝深度，并计算绒毛表面积(绒毛表面积=×肠绒毛高度×绒毛中段直径)。⑤脑组织中VEGF和CD34蛋白表达：分别于各时间点处死大鼠，每组取5只，标记额侧脑组织，置于多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片。采用免疫组织化学法检測脑组织中，VEGF和CD34蛋白表达。取病理切片，用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS水洗，分别于一抗(兔抗鼠VEGF和CD34)，二抗及过氧化物酶标记的链霉素和抗体孵育，PBS替代一抗为阴性对照，DAB染色15 min，苏木精复染，封片观察。VEGF蛋白存在于神经元与胶质细胞，CD34蛋白存在于内皮细胞的胞质，棕黄色为阳性，测定阳性细胞的吸光度(A)值。

1.4统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，计数资料用频数、百分比进行描述；采用t检验、方差分析和χ2检验进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1创伤性颅脑损伤对大鼠行为和脑组织含水量的影响

与对照组比较，创伤性颅脑损伤大鼠3 h～5 d，随着损伤时间的延长，大鼠的行为学评分和脑组织含水量明显增高(均P<0.05)，伤后24～72 h达到高峰(均P<0.05)，见表1。

表1　创伤性颅脑损伤对大鼠行为的影响±s)

与对照组比较，*P<0.05；与伤后3 h比较，△P<0.05；与伤后12 h比较，▲P<0.05；与伤后24 h比，#P<0.05

2.2创伤性颅脑损伤对大鼠肠黏膜显微结构的影响

对照组大鼠肠黏膜形态正常，肠黏膜绒毛结构完整，绒毛排列整齐，上皮细胞排列整齐，间质无水肿；创伤性颅脑损伤大鼠3 h～5 d，随着损伤时间的延长，肠黏膜绒毛的破坏越明显，绒毛间质越疏松、肠绒毛排列不规则甚至断裂，绒毛上皮坏死脱落，变矮，间距增宽，固有层出现不同程度水肿，见图1。

A：对照组；B：伤后3 h；C：伤后12 h；D：伤后24 h；E：伤后72 h；F：伤后5 d图1　创伤性颅脑损伤对大鼠肠黏膜的影响(苏木精-伊红染色，×100)Fig.1 Impact of traumatic brain injury on the intestinal mucosa of aged rats(HE staining，×100)

2.3创伤性颅脑损伤对大鼠肠屏障功能的影响

创伤性颅脑损伤后不同时间大鼠的肠绒毛高度、绒毛中段直径、隐窝深度和绒毛表面积均有不同程度的减少，上述指标在伤后3 h变化最小，伤后24～72 h减少最为明显(均P<0.05)，伤后5 d虽然有减少，减少趋势较小，见表2。

表2　创伤性颅脑损伤对大鼠肠屏障功能的影响±s)

与对照组比较，*P<0.05；与伤后3 h比较，△P<0.05；与伤后12 h比较，▲P<0.05；与伤后24 h比，#P<0.05

2.4创伤性颅脑损伤对大鼠脑内VEGF和CD34蛋白表达的影响

与对照组大鼠相比，创伤性颅脑损伤后不同时间大鼠VEGF和CD34蛋白表达均有不同程度的增高，伤后3 h变化最小，伤后24～72 h达到高峰(均P<0.05)，见表3和图2。

表3　创伤性颅脑损伤对大鼠脑内VEGF和CD34蛋白表达的影响±s)

与对照组比较，*P<0.05；与伤后3 h比较，△P<0.05；与伤后12 h比较，▲P<0.05；与伤后24 h比，#P<0.05

A：对照组；B：伤后3 h；C：伤后12 h；D：伤后24 h；E：伤后72 h；F：伤后5 d图2　创伤性颅脑损伤对大鼠脑内VEGF和CD34蛋白表达的影响(DAB染色，×100)Fig.2 Impact of traumatic brain injury on the expression of VEGF and CD34 in brain tissues of aged rats(DAB staining，×100)

3　讨论

创伤性颅脑损伤是常见的神经外科急症，是外伤中可致伤残或死亡的头号重症。因为创伤性颅脑损伤主要伤及脑部神经，临床病理表现较为复杂[5-8]。

创伤性颅脑损伤的应激状态使得内脏血流灌注量降低，低氧、缺血-再灌注损伤的刺激可影响肠黏膜屏障功能，表现在肠黏膜通透性升高、炎症介质的释放、细菌移位/失衡和肠源性感染[7]。本研究结果也显示了老年大鼠创伤性颅脑损伤后5 d内肠绒毛高度、绒毛中段直径、隐窝深度和绒毛表面积均有不同程度的减少，伴随肠黏膜绒毛破坏，绒毛间质疏松、肠绒毛排列规则甚至断裂，绒毛上皮坏死脱落，变矮，间距增宽和固有层出现不同程度水肿，以上肠病理变化均证实了创伤性颅脑损伤与肠道病理损伤密切相关。

继发性脑损伤对于评估创伤性颅脑损伤预后具有重要的参考价值。脑水肿是脑损伤的重要参数，创伤性颅脑损伤急性期的脑水肿病理本质在于血管源性水肿，呈渐进性发展，重度脑水肿则具有致命性。本研究结果显示，损伤后3 h的脑含水量较对照组已明显增高，提示创伤性颅脑损伤导致的脑内微血管头痛与胞质和基底膜间的细胞间隙渗出的水分有关。

VEGF是最重要的内源性血管再生因子，可通过激活Flk-1来实现内皮细胞的主要生理功能，也可以通过结合血管内皮细胞上的VEGF受体，促进内皮细胞的存活和增殖，因此VEGF几乎可干扰血管生成过程的所有阶段，可增大新生血管管腔，增多分支，促进内皮细胞间、内皮细胞与细胞外基质的连接，维持新生血管的结构及稳定性，增加血管通透性[9]。有研究认为VEGF表达增高与脑组织含水量增高有关，因此主张给予抗VEGF治疗创伤性颅脑损伤[10]，但笔者对此并不认可，因为与增加通透性相比，VEGF对于保护、稳定和建立新生血管具有明显优势，有利于脑损伤恢复的功能更明显。本研究显示创伤性脑损伤后VEGF水平可迅速升高，这是机体对脑组织缺血缺氧的代偿反应，VEGF升高有助于改善受损脑组织的血供并修复血管。类似的研究也显示了VEGF对缺氧缺血的即时反应，心脏骤停所致全脑缺血再灌注的大鼠脑内VEGF mRNA和VEGF蛋白可分别在2～3 d内达到高峰，并持续1周，缺血区VEGF表达有助于改善侧支循环。与VEGF相似，当大脑缺血缺氧情况下，CD34表达也增高，宓丹等[11]研究显示大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血区大脑皮层CD34表达明显增高，缺血再灌注24～72 h达到高峰，CD34表达与微血管密度同步，可见CD34具有诱导侧支循环的建立和微血管形成的功能。总之，VEGF和CD34表达增高是刺激机体产生内源性保护机制的物质体现。

综上，随着损伤时间的延长，大鼠的行为学评分增高，脑含水量增高，肠屏障功能降低，肠黏膜破坏，VEGF和CD34表达增高，这些异常的变化可在损伤后24～72 h达到高峰，该结果也与临床创伤性脑损伤后2～3 d是患者的危重时期吻合，因此密切关注并控制该时期的病情转归对降低病残和致死率应有积极意义，另外，既然VEGF和CD34表达是机体产生内源性保护机制的体现，那么增高其表达、促进血管再生可能是创伤性脑损伤后继发性脑损害治疗的新思路。

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(2016-01-12收稿)

Changes of the Expression of Regulatory Factors of Angiogenesis，Intestinal Mucosa and Intestinal Barrier Function in Aged Rats with Traumatic Brain Injury

Qian Chunsheng，Zhang Bin，Qian Tengdaetal

DepartmentofNeurosurgery,JintanAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Changzhou213200，China

ObjectiveTo investigate the changes of regulatory factors of angiogenesis，intestinal mucosa and intestinal barrier function in aged rats with traumatic brain injury.MethodsTraumatic brain injury models were established in healthy aged male SD rats weighing 500-600 g at age of 17-20 months.They were divided into 5 groups according to the injury time：3 h group，12 h group，24 h group，72 h group and 5 day group，with sham-operated group serving as the control group(n=10 each).The behavior，brain water content，intestinal microscopic characteristics，intestinal barrier function，VEGF and CD34 expression in brain tissues were examined and compared between groups.ResultsThe behavioral score，brain water content，VEGF and CD34 protein expression were significantly increased in brain tissues with the extension of traumatic injury(from 3 h to 5 d)(P<0.05).After the traumatic brain injury，the height of the intestinal villi，the diameter of the middle part of the villi，the crypt depth and the villus surface area were significantly decreased(P<0.05)；the intestinal mucosal villi were damaged；the villous stroma became loose；the stinal villi were irregularly arranged and even ruptured；the villous epithelial cells became necrotic，shorter，with the space widened；the lamina propria developed edema of different degree.The abnormalities reached a peak 24-72 h after injury(P<0.05).ConclusionMore attention should be paid to the period of 24-72 h after traumatic brain injury in aged rats.This period is of significance in the recovery of the condition and the decrease of the disability and the mortality.Increasing the expression of VEGF and CD34 protein and promoting the angiogenesis may help improve the second brain damage after traumatic brain injury.

aged rats；traumatic brain injury；regulatory factors of angiogenesis；intestinal mucosa；intestinal barrier function

R641；R574.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.005

钱春生，男，1983年生，主治医师，E-mail：20589378@qq.com