蒙药梅花草乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究△

辛　颖　达拉胡　红　艳（内蒙古民族大学蒙医药学院　通辽　028000）

蒙药梅花草乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究△

辛颖达拉胡红艳（内蒙古民族大学蒙医药学院通辽028000）

目的：研究蒙药梅花草乙醇提取物对人宫颈癌细胞（Hela细胞）的体外增殖抑制作用。方法：采用MTT法检测梅花草乙醇提取物的不同剂量组对Hela细胞增殖的抑制作用；以单克隆抗体ELISA法检测凋亡细胞。结果：梅花草乙醇提取物处理Hela细胞24h后，可以明显抑制Hela细胞的增殖。与对照组相比，梅花草乙醇提取物可以明显促进Hela细胞的凋亡。结论：蒙药梅花草的乙醇提取物体外对Hela细胞的增殖有抑制作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

梅花草乙醇提取物 Hela细胞 细胞凋亡 ELISA法

梅花草（Parnassis palustris L.），又称白侧草、马蹄草、黄草小白花，为虎耳草科梅花草属植物突隔梅花草的全草或根，蒙古名为那木戛纳、乌力地格和那木日因查干-其其格等，是蒙古族历代民间常用的特色蒙药，在现代蒙医临床应用中是治疗肿瘤及其相关疾病的常用蒙药材之一。梅花草气味甘、苦，无毒，具有清热解毒、消肿排脓、破痞、抑希日等功效，临床主要用于黄疸型肝炎、肺结核、喉炎、腮腺炎、脉管炎等，也可治疗腑器热性希日病和热性痞症，即治疗肝、胆肿瘤及部分肠道肿瘤（如结肠肿瘤）等［1，2］。

“破痞”属于一种蒙药功效，相当于现代医学中的抗肿瘤作用。现代蒙药药理学［3］认为具有破痞功效的蒙药具有抗肿瘤活性。蒙医理论认为“痞症”可发生于人体的各个器官，多属于继发于各种疾病的郁结性痼疾，发病原因主要是维持人体生命的“三根”（赫依、希日、巴达干）由于某种原因失去平衡，使“七素”（食物精华、血、肉、脂、骨、骨髓、精液）的转化过程中因积聚凝结而成浑浊、恶血激增、黄水淤积，在赫依的促动作用下，在人体的某一部位形成痞块。医治痞病，不但要破痞瘤也要判明发病原因，对症施治。长期以来，蒙医药学对于“痞症”的治疗方面积累了非常丰富的治疗方法和传统用药经验，临床疗效显著，副作用小，资源丰富。但存在的挑战在于如何利用现代医药学理念解释蒙医药“破痞”功效的机制。

近年来国内外学者对中药抗肿瘤作用机制及其有效物质基础进行了大量的研究，实验结果证实我国的传统中药具有良好的抗肿瘤效果，副作用较小［4，5，6］。据文献查阅，目前未见国内外专家和学者对蒙药梅花草活性化学成分和作用机制等方面的研究报道。从天然药物的发展趋势来看，应该将化学成分和药效学研究结合起来进行研究，应该以天然药物的有效部位为切入点，对其有效部位进行提取分离，了解其主要活性成分，进一步寻找其作用机制。本研究沿着天然药物研究的这一思路，首先拟用活性追踪法对蒙药梅花草的乙醇提取物的抗肿瘤作用进行研究，旨在通过体外实验初步评价梅花草乙醇提取物对人宫颈癌细胞（Hela细胞）的增殖是否具有抑制作用，进一步研究梅花草的抗肿瘤效果。

1　实验材料

1.1细胞：人宫颈癌细胞系（Hela细胞）购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2仪器：倒置相差显微镜（TS100型，日本尼康）；双人双面净化工作台（SW-CJ-2F型，苏州智净有限公司）；酶标仪（DNM-9602型，北京普朗责任有限公司）；水套式C02培养箱（3110系列，美国Thermo Scientific）；超纯水机（GYJ1/2-40L-S型，重庆华创责任有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-100A型，上海博讯有限公司）；鼓风干燥箱（DHG-9203A型，上海精宏有限公司）；电子调温电热套（98-1B型，天津市秦斯特仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-100型，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（德国Heidolph集团）；循环水式多用真空泵（SHZ-DIII型，郑州长城仪器有限公司）；96孔培养板及培养瓶（美国Corning公司）。

1.3试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；MTT（北京索莱宝科技有限公司）；胰酶（北京索莱宝科技有限公司）；生理盐水、乙醇、二甲基亚砜（DMS0）等试剂均购自天津科密欧公司。

2　实验方法

2.1药物制备：取一定量的梅花草（500g），用95%的乙醇浸泡后放于大圆底烧瓶中加热浸煮，每次煮3h，提取3次，每次所得的煮液合并为提取液，减压浓缩干燥后得浸膏，备用。经计算得提取率为33.26%。用DMS0作为梅花草乙醇提取物的溶剂用于细胞实验。

2.2MTT实验：用0.08%的胰酶消化Hela细胞后，将细胞浓度调整为1×105/mL，每孔100μL细胞悬液分别接种于96孔板中，培养24h后，分别加入不同浓度的梅花草乙醇提取物处理细胞，在C02培养箱内继续培养24h，小心吸弃每孔内的培养液，每孔再加入MTT工作液（5mg/mL）50μL，继续恒温（37℃）培养4h，终止培养后小心吸弃孔内MTT，每孔加入100μL DMS0，振荡2～3min后使用酶标仪（选择490nm波长）检测各孔的0D值，记录各组结果并计算抑制率。抑制率=（对照组0D值-实验组0D值）/对照组0D值×100%，实验重复3次，取平均值。

2.3ELISA检测凋亡细胞：Hela细胞加入梅花草的乙醇提取物处理24h后，用PBS洗涤2次，使用抗组蛋白和抗DNA的单克隆抗体ELISA法早期检测细胞凋亡，按试剂盒的说明方法进行操作，在酶标检测仪上于波长405nm处测定各孔0D值。凋亡细胞率以富集系数EF表示，EF值=（待测样品0D值-本底0D值）/阴性对照0D值×100%。

2.4统计学方法：应用SPSS17.0统计学软件进行分析，所有数据用均数±标准差表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为差异具有统计学意义。

3　实验结果

3.1梅花草乙醇提取物对Hela细胞的增殖抑制作用：梅花草乙醇提取物在浓度为12.5mg/mL时对Hela细胞表现出抑制其增殖的作用，结果见表1。

表1　梅花草乙醇提取物对Hela细胞增殖的作用

3.2梅花草乙醇提取物对Hela细胞凋亡的影响：与对照组相比，梅花草乙醇提取物浓度为12.5mg/mL的剂量组中凋亡细胞率（EF）明显升高（P＜0.05），结果见表2。

表2　梅花草乙醇提取物对Hela细胞凋亡的影响

4　讨论

肿瘤已经成为危害人类健康和幸福的杀手，防治肿瘤依然是世界性难题。目前对肿瘤采取的手术治疗、化学药物治疗和放射线治疗等手段的结合应用使多种肿瘤的治愈率有了极大的提高，但肿瘤细胞的多重耐药性和抗肿瘤药物的毒副作用使寻找新的抗肿瘤药物的研究刻不容缓。蒙药治疗肿瘤有独特的经验和方法，临床治疗时采用辨治施治的方法。蒙药用药剂量小，有高效、低毒、发挥复合药理作用、疗效可靠等优点，其有效成分的抗肿瘤作用及其机理的研究已成为当今医药学领域研究的重点。

本实验研究的结果显示，梅花草乙醇提取物的不同剂量组对Hela细胞可以表现出不同程度的抑制作用，且呈现剂量反应关系。细胞凋亡可以维持机体内细胞数量的动态平衡，进一步加强机体内环境的稳定，是细胞的一种基本生物学现象［7］。实验结果表明，梅花草乙醇提取物可以促进Hela细胞发生早期凋亡。综上所述，梅花草乙醇提取物在体外对Hela细胞有抑制作用，且其作用机制与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

［1］罗布桑.蒙药学［M］.北京：民族出版社，1989：459-460.

［2］奥乌力吉，布和巴特尔.传统蒙药与方剂［M］.呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，2013，8.

［3］王秀兰，白玉霞，王欢，等.蒙药药理学［M］.呼和浩特：内蒙古人民出版社，2006：82-87.

［4］尹龙，徐亮，胡格，等.抗肿瘤中药及其有效成分的作用研究现状［J］.动物医学进展，2006，27（1）：39-44.

［5］刘磊磊，陈娟，师彦平.清热解毒中药抗肿瘤作用研究进展［J］.中草药，2012，43（6）：1203-1212.

［6］梁欣娜，张兴燊，滕红丽.中药及其有效成分抗肿瘤作用研究［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：119-122.

［7］欧阳高亮，李祺福，洪水根.细胞凋亡与肿瘤的发生发展和治疗［J］.国外医学（肿瘤学分册），2000，27（5）：266-269.

R29

B

1672-8351（2016）09-0128-02

内蒙古自治区自然科学基金资助（2016MS0817）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZZ16184）。