HPLC法测定双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液的有关物质

李春盈　张玉英（广州市药品检验所　广州　510160）

HPLC法测定双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液的有关物质

李春盈张玉英（广州市药品检验所广州510160）

目的：建立HPLC法测定复方制剂双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液中的有关物质。方法：采用反相高效液相色谱法，以自身对照法计算双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液有关物质的量。用C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以甲醇-4%冰醋酸溶液（65∶35）为流动相，流速1.0mL/min，于波长为245nm处检测。结果：双氯芬酸钠与利多卡因杂质完全分离，有关物质的线性回归方程为A=22.139×C+ 2.3422，相关系数为r=0.9995（n=5）；方法的最低检出限为0.0089%。结论：实验证明该法简便快捷，能准确地测定样品的有关物质。

反相高效液相色谱法 双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液 有关物质

双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液是一种具有抗炎和止痛作用的复方制剂。双氯芬酸钠的主要作用机制为抑制环氧化酶活性，临床研究结果证明，该组分是有效、安全的非甾体类抗炎药。利多卡因属于局部麻醉药，具有快速止痛作用。双氯芬酸钠与利多卡因的复方制剂，不仅能提高双氯芬酸钠在溶液中的溶解性和稳定性，充分达到治疗效果，还可有效地减少注射点疼痛，减少注射部位组织损伤，增强镇痛效果。文献［1］报道肌注本品致过敏性休克等不良事件，本品为复方制剂，双氯芬酸钠在酸、碱、氧化、光照、高温条件下稳定性较差，盐酸利多卡因相对稳定。笔者承担了中国食品药品检定研究院委托的该品种标准转正工作，现借标准转正之机，对有关物质检查方法及限度进一步提高。双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液有进口药品注册标准JX20050125及国内2家企业试行标准，现版《美国药典》［2］和《英国药典》［3］均无收载本品复方制剂。笔者采用高效液相色谱法，能准确、快捷地测定复方中的有关物质，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，现汇报如下：

1　仪器和试药

1.1仪器：电子天平（德国赛多利斯CPA225D）、高效液相色谱仪（美国安捷伦1200型）。

1.2药品与试剂：双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液［某制药厂提供，批号：11042315201，规格：2mL：双氯芬酸钠75mg与盐酸利多卡因（以利多卡因计）20mg］，有关物质Ⅰ、有关物质Ⅱ和有关物质III（均由诺华制药有限公司北京分公司提供）冰醋酸、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（均为分析纯，均由广州化学试剂厂提供）、甲醇和乙腈（均为色谱纯，均由MERCK提供）。

2　方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱为C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-4%冰醋酸溶液（65∶35）；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；检测波长为245nm。

2.2系统适用性试验：取双氯芬酸钠对照品适量，用水制成每1mL中约含1mg的溶液，取该溶液暴露于紫外光灯（254nm）下照射15min，溶液作为系统适用性试验溶液。

2.3色谱行为：在上述“2.1”项下色谱条件，记录色谱图，在与双氯芬酸钠相对保留时间约0.8h处出现一杂质峰，杂质峰和双氯芬酸钠峰的分离度应不小于6.0，理论板数按双氯芬酸钠峰计算应不低于5000，见图1。

2.4方法专属性：取双氯芬酸钠原料，用适量甲醇溶解后用水稀释成每1mL中约含37.5mg的溶液，作为贮备液。取贮备液1mL，加入0.1mol/L盐酸溶液1mL，在水浴中加热30min，放冷，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至中性，用甲醇稀释至50mL，即得酸破坏性溶液；以0.1mol/L氢氧化钠溶液进行碱破坏性试验，并采用0.1mol/L盐酸溶液调节至中性；以3%的双氧水1mL进行氧化破坏，以水浴加热30min进行高温破坏，以254nm和366nm紫外灯下分别照射30min进行光照破坏试验。结果见图2，破坏产生的杂质不干扰测定，空白辅料亦无干扰。同法取盐酸利多卡因原料进行破坏，因利多卡因较稳定，在上述破坏条件下基本不产生干扰杂质，限于篇幅未附图谱。在本色谱条件下盐酸利多卡因无保留，其已知杂质2，6-二甲基苯胺保留时间为4.3min，不干扰测定。

2.5标准曲线的制备：精密称取双氯芬酸钠对照品10mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液。分别精密吸取贮备液适量，加甲醇稀释成每1mL含0.25～12.75μg的溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，计算线性回归方程为A=22.139×C+2.3422，相关系数为：r=0.9995（n=5）。

2.6最低检出限：取“2.5”项下标准贮备液，采用逐步稀释法制备不同浓度的样品，照“2.1”项下的色谱条件进样检查，当色谱图主成分的峰高约为基线噪音3倍时，计算得双氯芬酸钠检出限为0.0089%。

2.7供试品的测定：量取本品适量，用甲醇稀释制成每1mL中含双氯芬酸钠1.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用甲醇定量稀释制成每1mL中含双氯芬酸钠7.5μg的溶液，作为对照溶液。量取对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氯芬酸钠峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。1批样品检验结果为单个最大为0.2%，杂质总量为0.3%，供试品溶液色谱图见图3。

3　讨论

3.1有关物质的归属：本品为复方制剂，双氯芬酸钠在酸、碱、氧化、光照、高温条件下稳定性较差，而盐酸利多卡因相对稳定。故在有关物质检查中，将未知杂质均归属于双氯芬酸钠有关物质。已知杂质2，6-二甲基苯胺具有复方组分盐酸利多卡因的母体结构，因其为利多卡因的合成原料在本品的质量标准中按外标法作定量检查，以HPLC法同时测定已知杂质2，6-二甲基苯胺及盐酸利多卡因的含量，另文发表。

3.2色谱条件的选择：采用《英国药典》的流动相及C8色谱柱测定，理论板数较低，峰形欠佳，参照《中国药典》［4］2010年版二部双氯芬酸钠有关物质的方法，基线噪音较大，冰醋酸浓度越低，双氯芬酸钠色谱峰（主峰）与杂质峰分离越差［5］。收集到的双氯芬酸钠已知杂质有杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别对应于《英国药典》的杂质A、C、B，由于已知杂质仍较难购得，拟采用光照破坏产生杂质的方法考察系统适用性。采用三个品牌的色谱柱考察系统适用性，结果及已知杂质的分离情况见表1，拟定分离度应大于6.0，光照产生的杂质可能为杂质II，但须确认。

表1　有关物质检查系统适用性及已知杂质分离情况

3.3杂质限度的确定：《英国药典》收载的原料方法中，用HPLC主成分自身对照法检查单个杂质不得过0.2%，杂质总和不得过0.5%；《美国药典》双氯芬酸钠原料规定杂质A以HPLC外标法计算不得过0.2%，其他单个杂质以主成分自身对照法计算不得过0.2%，杂质总和不得过0.5%。进口药品注册标准采用TLC主成分自身对照法，对照溶液主斑点上方的杂质限度为1.0%，下方的杂质限度为0.5%，杂质总和不得过1.0%。《中国药典》2010年版双氯芬酸钠原料规定单个杂质不得过0.2%，杂质之和不得过0.5%，肠溶片中单个杂质不得过1.0%，杂质之和不得过1.5%。本品为注射剂，拟定单个杂质不得过0.5%，杂质总量不得过1.0%。

［1］胡利群，方琴，苏洲.肌注双氯芬酸钠盐酸利多卡因注射液致过敏性休克1例 ［J］.中国医院用药评价与分析，2015，15（12）：1709-1710.

［2］《美国药典》［S］.USP39-NF34 ed..Rockville：U.S.Pharmacopeial Convention，2015.

［3］《英国药典》［S］.British Pharmacopoeia.2015，VolⅠ British Pharmacopoeia Commission，2015.

［4］中华人民共和国药典［S］.2010年版，二部，北京：中国医药科技出版社，2010.

［5］李玮玲.双氯芬酸二乙胺凝胶剂的含量测定 ［J］.北方药学，2014，11（8）：1-2.

Determination of Diclofenac sodium and Lidocaine Hydrochloride Injection related substances by HPLC

Li Chunying Zhang Yuying（Guangzhou Institute for Drug Control，Guangzhou，Guangdong，China 510160）

0bjective：To establish a HPLC method for the determination of Diclofenac sodium and Lidocaine Hydrochloride Injection related substances.Methods：The sample was analyzed on a C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisting of methonal-4%Acetic Acid（65∶35）.The flow rate was 1.0mL/min and the detection wavelength was 245nm.Results：The peaks of Diclofenac，Lidocaine and its impurities were completely separated.The regression equation for related substances was A=22.139×C+2.3422，r= 0.9995（n=5）.The detection limit was 0.0089%.Conclusions：This method is convenient，quick and reproducible for the quantitative determination of Diclofenac sodium and Lidocaine Hydrochloride Injection in the related substances.

HPLC Diclofenac sodium and Lidocaine Hydrochloride Injection Related substances

R927.2

A

1672-8351（2016）09-0001-02