甜柿果实总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化研究

杨谷良，龙　涛，韩　露，王艺雅，李士明*

（1.黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈438000；2.黄冈师范学院大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北黄冈438000）

甜柿果实总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化研究

杨谷良1，2，龙涛2，韩露1，王艺雅1，李士明1，2*

（1.黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈438000；2.黄冈师范学院大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北黄冈438000）

为确定罗田甜柿果实中总黄酮的最佳提取工艺条件及其抗氧化性，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken组合试验设计、响应面优化试验，得到柿果总黄酮提取的最佳条件：提取时间2.5 h，提取温度75℃，乙醇体积分数75%，液料比13∶1（mL∶g）。在此条件下，柿果总黄酮的提取率为2.27%。柿果总黄酮对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率为89.72%，证实柿果具有一定抗氧化性。

柿子；总黄酮；响应面法；抗氧化性

柿子（Diospyruskaki Thunb.）属于柿属柿科落叶果树［1］，原产于我国长江流域及其以南地区，在我国至少有2 200年的栽培历史［2］。2011年，我国柿树栽培面积己达1.09×107亩，柿果产量达到3.259×109kg［3］。柿果中含有机酸、鞣质、多酚、糖类、维生素C、食用纤维、三萜酸，类胡萝卜素以及类黄酮等多种有机物，具有抗肿瘤、抗衰老、降血压、降血脂、降胆固醇、软化血管、健肤美容等生理作用［4］。柿叶和柿果等被加工成了柿叶茶［5］、柿子醋［6］、柿酒［7］、醋酸饮料［8］等。韩卫娟等［9］研究了15份柿叶中总黄酮含量的年动态变化，发现柿叶中总黄酮的含量为12.06～58.20 mg/g。黄酮类物质具有抗氧化、清除自由基和鳌合二价阳离子等广泛的生物学效应［10］，林国荣等［11］也报道柿黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、扩张血管等生理功能。

黄酮的提取方法很多，如索式提取法、加热提取法、有机溶剂提取法、酶法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等［12］。其中，有机溶剂提取法具有黄酮提取效率高、提取方法简便、不需要复杂的仪器设备等优点。董江涛等［13］采用响应面法优化微波辅助提取柿叶中的总黄酮，柿叶黄酮的提取率达到6.15%。王恒超等［14］确定了微波辅助法提取柿黄酮最佳提取条件：乙醇体积分数70%、微波功率600W、提取时间150 s、料液比1∶30（g∶m L），黄酮提取量达到42.4 mg/g。周吴萍等［15］发现，当乙醇体积分数为50%，料液比为1∶60（g∶m L），提取温度为90℃，提取时间45 m in，总黄酮的提取率可达7.59%。本研究利用乙醇溶液提取柿果实黄酮类化合物，通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除实验，确定提取柿果实总黄酮的最佳提取工艺并探讨柿果总黄酮抗氧化活性，以期为柿子的综合开发利用提供一定的实验数据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

甜柿果实：于2015年10月，在黄冈市罗田县甜柿种植基地采集的近成熟果实。

芦丁标准品（纯度＞98%）：国药集团化学试剂有限公司；DPPH：美国Sigma公司；无水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、NaH2PO4、Na2HPO4、维生素C、甲醇、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

PB2002-10 Metter-Toledo Group电子天平：梅特勒-托利多国际有限公司；GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；722S可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；RE-5220旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HH-8电子恒温水浴锅：深圳国华仪器厂。

1.3方法

1.3.1柿果总黄酮的提取工艺

甜柿果实→除核→切片→烘干（65℃）→粉碎过80目筛→乙醇溶液浸泡提取→过滤→减压蒸馏→总黄酮粗提物

1.3.2芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的绘制：精密量取芦丁标准溶液（0.1 mg/m L）0、1.00 m L、2.00 m L、3.00 m L、4.00 m L、5.00 m L分别置于25 m L容量瓶中，依次加入5 m L体积分数60%乙醇，1.0 m L 5%NaNO2，摇匀，放置5 min，加入1.0 m L 10% Al（NO3）3，摇匀，放置5 min，加入10 m L 4%NaOH，摇匀，再用体积分数60%乙醇定容，摇匀，放置15 m in，在波长510 nm处测定吸光度值。以吸光度值（y）为纵坐标，芦丁质量浓度（x）为横坐标，绘制芦丁标准曲线。

1.3.3柿果总黄酮提取单因素试验

设置提取时间：1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0h；提取温度：70℃、75℃、80℃、85℃、90℃；乙醇体积分数：60%、70%、80%、90%、100%；液料比：9∶1、11∶1、13∶1、15∶1、17∶1（m L∶g）。取一定量的柿果粉末，经乙醇浸泡提取并过滤后，减压蒸馏得提取物，提取物经体积分数50%乙醇溶解后，定容至100 m L。取上述溶液5 m L，用体积分数50%乙醇定容至50 m L后，取1 m L，加入0.15 m L浓度为5%的NaNO3溶液，充分摇匀后，静置6 m in，然后加入2 m L含量为4%的NaOH溶液，加入体积分数70%的乙醇至总体积25 m L，摇匀后静置15 min，测量波长510 nm处的吸光度值A。根据下面的公式计算出总黄酮提取率：

式中：y为通过回归方程计算出的芦丁含量，mg；50和20为稀释倍数；N为100除以100 g柿鲜果干燥后的干粉质量；w为所称取干粉的质量，mg。

1.3.4柿果总黄酮提取工艺的优化

表1　响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

根据单因素试验结果，以提取时间（A）、提取温度（B）、乙醇体积分数（C）和液料比（D）为评价因素，设计响应面试验，因素与水平如表1所示。

1.3.5柿果总黄酮清除DPPH自由基能力的测定

参照郑朋朋等［16］的方法。分别取0.1 m L不同质量浓度（50μg/m L、100μg/m L、150μg/m L、200μg/m L、250μg/m L）的总黄酮提取液，加入5 m L 100 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混匀并避光静置30 min后，测定波长517 nm处的吸光度值，以提取溶剂为空白对照，以VC为阳性对照。DPPH清除率的计算公式如下：

式中：A0为空白溶液吸光度值；Ax为加入样品后的体系吸光度值；Ax0为样品本底吸光度值。

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线

以芦丁质量浓度（x）为横坐标、波长510 nm处的吸光度（y）值为纵坐标绘制芦丁标准曲线，结果见图1。由图1可知，所得线性回归方程为y=1.218 1x-0.004 3，相关系数R2= 0.996 4。表明在一定范围内，吸光度值与芦丁质量浓度间的线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.1.1提取时间对柿果总黄酮提取率的影响

图2　提取时间对柿果总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids in persimmon

由图2可知，在整个提取过程中，随着提取时间的延长，柿果总黄酮的含量不断增加。当提取时间＜2.5 h时，随着提取时间的延长，总黄酮含量快速增加。这是因为随着时间的延长，总黄酮逐渐被浸提出来。当提取时间继续增加时，总黄酮含量的增加趋势逐渐减缓，这是由于随着时间的延长，大部分总黄酮被提取出来，而且，原料中的淀粉和蛋白质等物质也更多地释放出来，提取液的黏度增大，增加后续离心、浓缩、过滤等的难度，提取效率降低。因此，2.5 h为适宜的提取时间。

2.1.2提取温度对柿果总黄酮提取率的影响

图3　提取温度对柿果总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction tem perature on extraction rate of flavonoids in persimm on

由图3可知，当提取温度＜75℃时，柿果总黄酮的提取率随着提取温度的升高而不断增加。当提取温度＞75℃时，随着提取温度的升高，柿果总黄酮的提取率反而出现下降。因此，选择75℃的提取温度最为适宜。

2.1.3乙醇体积分数对柿果总黄酮提取率的影响

图4　乙醇体积分数对柿果总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of e thanol concentration on extraction rate of flavonoids in persimmon

由图4可知，乙醇体积分数60%～70%，随着乙醇体积分数的增加，柿果总黄酮的提取率逐渐升高，但是，当乙醇体积分数＞70%以后，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮含量逐渐降低。考虑到提取效率和提取成本，选择体积分数70%的乙醇为宜。

2.1.4液料比对柿果总黄酮提取率的影响

图5　液料比对柿果总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of flavonoids in persimm on

由图5可知，当液料比9∶1～13∶1（m L∶g），随着液料比的增加，柿果总黄酮的提取率逐渐增加，当液料比＞13∶1（m L∶g）时，柿果总黄酮的提取率开始下降，这是由于当液料比达到13∶1（m L∶g）时，柿粉末与提取液能够充分接触。进一步增大液料比，不会促进柿果总黄酮溶出，反而增加了后续离心、浓缩和过滤的难度，降低了柿果总黄酮的提取率。因此，液料比以13∶1（m L∶g）最适宜。

2.2响应面试验结果与分析

通过Design-Expert软件，以柿果总黄酮提取率（Y）为响应值，选取提取温度（A）、乙醇体积分数（B）、液料比（C）和提取时间（D）4个因素，对柿果黄酮的提取条件进行了响应面分析。对各因素进行二次多项式回归拟合后，得到柿果总黄酮提取率（Y）对A、B、C和D的二次多项回归方程：

由表3可知，该回归模型的F值为7.09，P=0.0004＜0.01，达到极显著水平；失拟项的F值为15.40，P=0.069 0＞0.05，影响不显著；方程的决定系数R2=0.996 3，表明响应值的变化有99.63%来源于所选变量，说明该模型拟合结果良好，试验误差小。对交互作用显著的因素进行分析，得到响应曲面及等高线图（见图6）。

由图6可知，因素对柿果总黄酮提取率的影响，以提取温度最显著，表现为曲线较陡，而提取时间的影响相对较小，表现为曲线较为平滑。

根据响应面分析结果，乙醇浸提法提取柿果黄酮的最佳工艺条件为提取时间2.73 h，提取温度74.32℃，乙醇体积分数74.13%，液料比12.87 m L/g。在此条件下柿果黄酮的提取率为2.271%。

表2　柿果总黄酮提取工艺优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface ana lysis for persimm on flavonoids extraction process optim ization

表3　响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

图6　提取时间、温度、乙醇体积分数和液料比对柿果总黄酮提取率影响的响应曲面和等高线Fig．6 Response surface p lots and contour line of effects of extrac tion tim e，tem perature，ethanol concentration and liquid-solid ratio on persimmon flavonoids extraction rate

2.3验证试验

为了检验响应面法得到结果的可靠性，采用上述优化的提取条件进行乙醇浸提法提取柿果总黄酮的试验。考虑到实际操作情况，将试验条件修正为提取时间2.5 h，提取温度75℃，乙醇体积分数75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此条件下测试3次，柿果总黄酮的平均提取率为2.269%，实际值与理论值相近，可见该模型可以很好地反映各因素对柿果黄酮提取率的影响，同时也证明了用该方法研究柿果黄酮提取率的可行性。

2.4清除DPPH自由基的能力

图7　不同质量浓度柿果总黄酮与VC清除DPPH自由基能力Fig.7 The scavenging capacity of different content of persimmon flavonoids and VC on DPPH free radical

由图7可知，随着柿果总黄酮质量浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增强。当柿果总黄酮的质量浓度增加至0.25 mg/m L时，自由基清除率达到最大36.02%。和相同质量浓度的对照VC相比，柿果总黄酮的自由基清除率更强。结果说明柿果总黄酮具有较强的抗氧化能力。

3　结论

通过对提取时间、提取温度、乙醇体积分数、液料比进行单因素试验的基础上，利用Box-Behnken组合试验设计和响应面优化试验，得到柿果总黄酮提取的最佳条件：提取时间2.5 h，提取温度75℃，乙醇体积分数75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此条件下，柿果黄酮的提取率为2.269%。建立的回归方程拟合度良好，预测值检测值基本一致。体外的抗氧化研究结果表明，柿果总黄酮具有较强的清除DPPH自由基能力，具有一定的抗氧化活性。

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Optim ization of extraction technology of total flavonoids from persimmon fruit and its antioxidant activities

YANG Guliang1，2，LONG Tao2，HAN Lu1，WANG Yiya1，LI Shim ing1，2*
（1.College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for the
Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China）

In order to optim ize extraction conditions of flavonoids from the fruit of Luotian non-astringent persimmon and its antioxidant activities，on the basis of single factor experiments，the optimum extraction conditions of persimmon flavonoids were obtained by Box-Behnken experiments and response surface methodology.The optimum extraction conditions were extraction time 2.5 h，temperature 75℃，ethanol concentration 75%，liquid-solid ratio1 13∶1（m l∶g）.Under the conditions，the extraction ratio of persimmon flavonoids was 2.27%，and the scavenging capacity of persimmon flavonoids on 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）free radical was 89.72%，which confirmed that persimmon had certain antioxidant activities. Key words：persimmon；total flavonoids；response surface methodology；antioxidant activity

R285

0254-5071（2016）05-0081-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．017

2016-02-23

湖北省自科基金（2006ABA 186）；湖北省自科基金青年项目（Q200727004）；国家自然科学基金青年基金项目（31500995）作者简介：杨谷良（1974-），男，副教授，博士，研究方向为农业资源开发与利用。

李士明（1963-），男，教授，博士，研究方向为功能食品与健康、疾病预防。