高效液相色谱法同时测定糕点中富马酸二甲酯与纳他霉素

刘　琦，高志莹，洪　霞，吴永宝，马　燕，周鑫魁，邓丽娟，何海宁

（甘肃省商业科技研究所甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州730010）

高效液相色谱法同时测定糕点中富马酸二甲酯与纳他霉素

刘琦，高志莹，洪霞，吴永宝，马燕，周鑫魁，邓丽娟，何海宁

（甘肃省商业科技研究所甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州730010）

建立高效液相色谱法同时测定糕点中富马酸二甲酯与纳他霉素的检测方法。样品经10 mL甲醇溶解、超声提取后，采用Phenomenex Gem ini C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）分离，以甲醇与20 mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，V/V）为流动相，两者分离效果较好。富马酸二甲酯与纳他霉素在0.5～20.0 μg/m L质量浓度范围内线性关系良好（R2=0.999 9），检出限（LOD）（S/N=3）分别为0.04 mg/kg与0.20 mg/kg。加标回收率分别为94.430%～99.616%和95.860%～101.968%，精密度试验结果变异系数（CV）分别为1.09%～2.02%和1.54%～2.66%。该方法与国标方法测定样品中富马酸二甲酯与纳他霉素含量的相对标准偏差（RSD）分别为0.789%和0.918%，符合方法学要求，表明该方法准确可靠、精密度良好，可用于实际样品中富马酸二甲酯与纳他霉素的同时测定。

高效液相色谱；同时测定；糕点；富马酸二甲酯；纳他霉素

糕点类食品在生产和销售过程中容易霉变、酸败。生产企业为了保证质量和风味，延长货架期，往往过量添加允许范围内的防腐剂，甚至添加禁止使用的防腐剂，如富马酸二甲酯（dimethy fumarate，DMF）［1］、纳他霉素（natamycin）等。富马酸二甲酯又称反丁烯二酸二甲酯，俗名霉克星1号和防霉保鲜剂［2］，具有广谱高效的抗菌特性，对30多种霉菌、酵母菌和细菌都有很好的抑菌效果，广泛应用于食品、化妆品和皮革等产品的防霉［3］。研究表明，食品中的富马酸二甲酯易水解生成甲醇，对人体肠道、内脏造成损害，长期食用还会对肝、肾有很大的副作用，尤其对儿童的生长发育造成极大危害［4］。纳他霉素也称游链霉素、匹马霉素或海松素，是一种天然的大环内酯类抗生素［4］，能有效的抑制酵母菌等真菌的生长［5］。作为一种新型防腐剂，纳他霉素已被广泛应用于乳酪、果汁、肉制品和糕点等食品中［6］。国标GB 2760—2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定富马酸二甲酯不允许使用在食品中，同时，纳他霉素的最大使用量为0.3 g/kg［7］。因此，为了确保糕点制品的安全，对富马酸二甲酯与纳他霉素的使用进行有效地检测、监控是非常必要的。

目前，对食品中富马酸二甲酯的检测方法主要有薄层法［8］、气相色谱（gas chromatography，GC）法［9-10］、液相色谱（liquid chromatogram，LC）法［11-12］、气相色谱-质谱联用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）法［13-15］，食品中纳他霉素的检测方法主要有高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC）法［16-19］、液相色谱-质谱法［20］、分光光度法［21］、电化学法［22］等。本研究旨在探索用甲醇-水提取糕点中的富马酸二甲酯及纳他霉素，处理后利用高效液相色谱法同时测定糕点中的富马酸二甲酯及纳他霉素的含量，以期建立一种准确、可靠、快速、简便的分析方法检测糕点中的富马酸二甲酯与纳他霉素，保障糕点制品安全。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

某品牌糕点：市售。

富马酸二甲酯标准品（纯度99.0%）、纳他霉素标准品（纯度89.9%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸铵（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司；磷酸氢二铵（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；丙酮（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；乙酸乙酯（色谱级）：山东禹王实业有限公司。

1.2仪器与设备

Agilent1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；Phenomenex GeminiC18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美国菲罗门公司；XS225A-SCS电子天平：瑞士普利赛斯公司；VORTEX GENIUS3涡旋器：德国IKA公司；SB-5200DTN超声波机：宁波新芝生物科技股份有限公司；CF16RXⅡ离心机：日本日立公司；UPH-1超纯水仪：四川优谱超纯科技有限公司。

1.3方法

1.3.1标准储备液的配制

标准储备液：分别称取富马酸二甲酯、纳他霉素标准品10.00mg于10m L容量瓶中，分别用纯甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1 mg/m L的富马酸二甲酯和纳他霉素的标准储备液，于4℃冷藏备用。

1.3.2色谱条件

Phenomenex Gem ini C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，B为20 mmol/L乙酸铵溶液，流动相梯度洗脱程序见表1；流速1.0 m L/min；进样量10 μL；柱温30℃；检测波长：0～6.0 min为220 nm，6.0 min～20.0 min为305 nm。

表1　梯度洗脱程序Table1 Gradient elution program

1.3.3样品前处理

样品经均匀粉碎后，称取5.00g样品于25m L比色管中，用少量水溶解样品后，加入10m L甲醇提取，涡旋混合3 m in后，超声提取30 min，用水定容至25 m L，摇匀，转入50 m L离心管中，5℃、10 000 r/m in离心5 m in，上层清液过0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC检测分析。

2　结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1流动相的选择

参考相关文献［17，23-25］，本研究选用甲醇与20 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，固定其他色谱条件不变的情况下，不断改变流动相甲醇与20 mmol/L乙酸铵的起始比例40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40（V/V）。经实验得出，当流动相甲醇与20 mmol/L乙酸铵的起始比例为40∶60（V/V）和45∶55（V/V）时，富马酸二甲酯出峰响应不高且杂峰较多，55∶45（V/V）时纳他霉素的响应过低且峰型不好，流动相起始比例为60∶40（V/V）时富马酸二甲酯与纳他霉素峰型均不对称，但是甲醇与20mmol/L乙酸铵比例为50∶50（V/V）时富马酸二甲酯与纳他霉素两者均完全分离且峰型较好。因此确定流动相甲醇与20mmol/L乙酸铵的起始比例为50∶50（V/V）。

2.1.2检测波长的选择

分别取10 μg/m L富马酸二甲酯与纳他霉素标准储备液，在波长200～400 nm范围内扫描，结果显示，富马酸二甲酯在波长210 nm处有最大吸收，纳他霉素在波长305 nm处有最大吸收。因此，设定波长为210 nm，在富马酸二甲酯完全出峰后将检测波长设置为305 nm。

2.2提取条件的选择

2.2.1提取溶剂的选择

据文献报道，常用甲醇［11，23，26］、乙酸乙酯［27-29］、乙腈［30］、丙酮［31］等溶剂提取富马酸二甲酯；用甲醇［16-19］、丙酮［16］、乙酸乙酯和乙腈［32］等溶剂提取纳他霉素。本研究在样品中分别添加25 mg/kg富马酸二甲酯与纳他霉素的标准品，加入少量水溶解后，再分别加入10 m L的甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮进行提取，考察4种提取剂对富马酸二甲酯与纳他霉素回收率的影响，结果见图1。

图1　不同溶剂提取效果Fig.1 Effect of different solvents on the extraction

由图1可知，甲醇对富马酸二甲酯与纳他霉素的回收率均明显高于其他溶剂，其次是丙酮和乙腈，乙酸乙酯的回收率最低。根据提取效率结合经济性与安全性，选择甲醇作为提取溶剂。

2.2.2提取溶剂体积的选择

选用甲醇作为提取溶剂，考察提取剂提取体积5 m L、10 m L、15 m L、20 m L对样品中富马酸二甲酯与纳他霉素的回收率的影响，结果见图2。

图2　提取液体积对富马酸二甲酯与纳他霉素提取效果的影响Fig．2 Effect of extraction solution volume on extraction of dimethyl fumarate and natam ycin

由图2可知，甲醇体积为5 m L时，富马酸二甲酯和纳他霉素的回收率较低，由于水相比例较大，富马酸二甲酯在甲醇、乙醇中具有一定的溶解度，在水中溶解度较低［33-34］，同时，纳他霉素在水中溶解度也较低［17］；甲醇为10 m L时，富马酸二甲酯与纳他霉素的回收率均达到了最大值；甲醇体积为15 m L时，富马酸二甲酯回收率较低；甲醇体积为20 m L时，纳他霉素回收率较低且甲醇溶解出样品中较多杂质，容易产生干扰峰并污染色谱柱。因此，综合考虑选用10 m L甲醇作为提取液。

2.3标准品和样品的高效液相色谱检测

将富马酸二甲酯与纳他霉素标准溶液和样品在确定的色谱条件下进行检测，得到2种标准品及样品的色谱图分别如图3、图4所示。

图3　标准溶液的高效液相色谱图Fig．3 HPLC chromatogram of standard solution

由图3可知，在已确定的洗脱条件下，即甲醇与20mmol/L乙酸铵50∶50（V/V）作为起始比例进行梯度洗脱，富马酸二甲酯与纳他霉素标准均能完全分离且分离度高，峰型较好。

图4　样品的高效液相色谱图Fig．4 HPLC chromatogram of the sam ple

由图4可以看出，样品中的杂质峰与富马酸二甲酯标准峰完全分离，未干扰目标物出峰，样品中富马酸二甲酯与纳他霉素峰完全分离，说明在此条件下可以完全分离两个目标物，分离效果较好。

2.4标准曲线及检出限

分别吸取富马酸二甲酯与纳他霉素的标准储备液各0.05 m L、0.10 m L、0.20 m L、0.50 m L、1.00 m L、2.00 m L于6个10 m L容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成质量浓度分别为0.5μg/m L、1.0μg/m L、2.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L的系列浓度梯度溶液，在色谱条件下进行测定，以标准溶液质量浓度（x）和峰面积（y）制作标准曲线。富马酸二甲酯与纳他霉素在0.5～20.0 μg/m L质量浓度范围内的线性回归方程、相关系数及检出限结果见表2。

表2　富马酸二甲酯和纳他霉素的回归方程、相关系数和检出限Table 2 Regression equation，correlation coefficient and lim it of detection of dimethyl fumarate and natam ycin

由表2可知，富马酸二甲酯与纳他霉素的线性相关系数R2均为0.999 9，表明2种化合线性关系良好。以仪器测量时3倍信噪比，测得方法检出限分别为0.04mg/kg和0.20mg/kg，均低于国标方法检出限0.05 mg/kg和0.50 mg/kg，此方法能满足富马酸二甲酯与纳他霉素的定量分析要求。

2.5方法回收率试验

在糕点样品分别添加10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg3个水平的富马酸二甲酯与纳他霉素标准品进行加标回收率试验，每个水平设置6个平行样，并计算其加标回收率，结果如表3所示。

表3　加标回收率和精密度试验结果（n=6）Table 3 Results of adding standard recovery rates and precision tests（n=6）

由表3可知，富马酸二甲酯的回收率为94.430%～99.616%，纳他霉素的回收率为95.860%～101.968%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中要求的被测组分含量为1～100 mg/kg样品回收率范围为90%～110%的要求，说明本试验方法的测定结果准确可靠，可用于糕点中富马酸二甲酯与纳他霉素含量的检测。同时，本试验中富马酸二甲酯与纳他霉素的实验室内变异系数（coefficient of variation，CV）分别是1.09%～2.02%和1.54%～2.66%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检验》中要求的被测组分含量≤100 mg/kg时，实验室内变异系数（CV）≤5.3%，表明该方法精密度良好，能满足定量分析要求。

2.6糕点中富马酸二甲酯和纳他霉素的测定

采用NY/T 1723—2009《食品中富马酸二甲酯的测定高效液相色谱法》和GB/T 21915—2008《食品中纳他霉素的测定液相色谱法》中的方法与该方法分别测定样品中富马酸二甲酯和纳他霉素的含量，验证本试验方法的准确性，结果见表4。

表4　本试验方法与国标方法测定的对比结果Table 4 Comparison results of the method w ith national standard m ethod

由表4可知，采用本试验方法测得样品中富马酸二甲酯含量为2.765 mg/kg，纳他霉素含量为10.220 m g/kg；国标方法测得样品中富马酸二甲酯含量为2.787 mg/kg，纳他霉素含量为10.127 mg/kg，相对偏差分别为0.789%和0.918%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检验》附录F中要求的含量为10～1 000 mg/kg样品的检测结果偏差范围＜15%，说明该方法与国标相比准确可靠，可用于糕点样品中富马酸二甲酯与纳他霉素的测定。

3　结论

本研究采用高效液相色谱法建立了同时测定糕点中富马酸二甲酯与纳他霉素的检验方法。选用10 m L甲醇作为提取液，Phenomenex Gem iniC18色谱柱（150mm×4.6mm，5 μm）分离，以甲醇-20 mmol/L乙酸铵（50∶50）为流动相，该方法分离效果较好，杂质干扰少，能有效地将目标峰和杂质峰分离。富马酸二甲酯与纳他霉素在0.5～20.0 μg/m L质量浓度范围内的线性关系良好（R2均为0.999 9），方法检出限分别为0.04 mg/kg和0.2 mg/kg，富马酸二甲酯的回收率为94.430%～99.616%，纳他霉素的回收率为95.860%～101.968%，精密度试验结果CV值分别为1.09%～2.02%和1.54%～2.66%，该方法测定糕点样品中富马酸二甲酯和纳他霉素含量分别为2.765 mg/kg和10.220 mg/kg。国家标准方法测得结果为富马酸二甲酯和纳他霉素含量分别为2.787 mg/kg和10.127 mg/kg，相对标准偏差分别为0.789%和0.918%，说明该方法测定结果准确可靠、精密度良好，结果偏差符合方法学要求，对于实际样品中富马酸二甲酯与纳他霉素的同时测定具有重要意义。

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Simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in cake by HPLC

LIU Qi，GAO Zhiying，HONG Xia，WU Yongbao，MA Yan，ZHOU X inkui，DENG Lijuan，HE Haining
（Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.，Ltd.，Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，China）

The detection method was established for the simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in food by HPLC.After dissolved in 10 m l methanol and extracted with ultrasonic，the sample was separated by Phenomenex Gemini C18chromatographic column（150 mm×4.6mm，5 μm）.W ith methanol and 20 mmol/L ammonium acetate solution（50∶50，V/V）as mobile phase，the separation efficiency of dimethy fumarate and natamycin was good.The dimethy fumarate and natamycin had a good linear relationship in the range of 0.5-20.0 μg/m l（R2=0.999 9），and the lim it of detection（S/N=3）were 0.04 mg/kg and 0.20 mg/kg，respectively.The coefficient of variation of precision tests results were 1.09%-2.02%and 1.54%-2.66%，respectively.The relative standard deviation（RSD）of the method and national standard method for determ ining the content of dimethy fumarate and natam ycin in sample was 0.789%and 0.918%，respectively，which was accorded w ith the requirements of the methodology. Due to its reliable accuracy and good precision，the method was suitable for simultaneous determ ination of dimethy fumarate and natamycin in actual sam ple.

HPLC；simultaneous determ ination；cake；dimethy fumarate；natamycin

O657．7

0254-5071（2016）05-0182-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．038

2016-01-11

流通领域动物源性制品质量安全技术创新服务平台（1306TTPA036）；甘肃省动物源性制品安全分析与检测技术重点实验室（1309RTSA 025）；甘肃省动物源性制品快速检测工程技术研究中心（1009FTGA 018）；中-马清真食品国家联合实验室食品检测平台建设（1505JTCA017）

刘琦（1986-），女，工程师，硕士，研究方向为食品科学。