具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌的研究

张卉，钱国强，*，李宾（.黄淮学院护理学系，河南驻马店463000；.黄淮学院生物工程系，河南驻马店463000）

具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌的研究

张卉1，钱国强1，*，李宾2
（1.黄淮学院护理学系，河南驻马店463000；2.黄淮学院生物工程系，河南驻马店463000）

沙门氏菌是常见的食源性致病菌之一，有研究报道乳酸杆菌可以有效的抑制某些致病菌，然而对于能够拮抗沙门氏菌的乳酸杆菌的报道并不常见。筛选出了一株具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌，并对其抑菌物质的特性进行研究；结果表明3号植物乳杆菌（L.plantarum）对沙门氏菌具有较强的抑制能力，其抑菌物质中包含了细菌素、有机酸和过氧化氢。此外，乳酸杆菌的抑菌物质也具有较强的热稳定性。

沙门氏菌；乳酸杆菌；拮抗；抑菌物质

沙门氏菌（Salmonella）属于肠杆科，无芽胞革兰氏阴性杆菌，能够感染人导致严重的食物中毒和败血症，严重的危害着消费者的身体健康［1-2］。该病原菌主要通过污染猪肉、鸡蛋、新鲜果蔬和牛奶等食品侵染人体，由于上述原因引起的食物中毒占每年我国食源性疾病的70%～80%［3-6］。目前，防治沙门氏菌疾病的主要方法是使用抗生素药物，然而，抗生素的长期使用会导致日益严重的耐药性和抗生素药物残留的问题［7］。因此，一种不依赖于抗生素的沙门氏菌抑制方法显得十分必要。乳酸杆菌是一种能够定植于人体肠道，并对人体的肠道疾病有一定的治疗作用，其中则包含了由于沙门氏菌感染造成的腹泻，这也说明了乳酸杆菌对沙门氏菌具有一定的拮抗能力［8-9］。

本试验选取经过初步筛选已经确定具有拮抗沙门氏菌的8株乳酸杆菌，对其进行耐人工胃液和肠液实验，并将其与沙门氏菌进行共培养，筛选出了具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌，初步确定了乳酸杆菌的抑菌物质，分析了pH及热对乳酸杆菌抑菌成分的影响，为食源性沙门氏菌的防控和治疗提供了理论依据。

1　材料与仪器

1.1主要材料

1.1.1供试菌株

鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium ATCC 14028），本试验中的8株乳酸杆菌已经利用牛津杯法进行了初步的筛选，且其来源，菌属等信息如表1所示，上述供试菌株均来自本实验室菌种库。

表1　乳酸杆菌菌株信息Table 1　Lactobacillus strain information

1.1.2试剂

溶菌肉汤（Lysogeny Broth，LB）、缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、DHL琼脂培养基、MRS液体培养基、XLD培养基：上述培养基均购买自青岛海博生物有限公司；胰蛋白酶（15.23 U/mg）：北京绿源大德生物科技有限公司；牛胆盐、过氧化氢酶（70.5U/mg）：上海至鑫化工有限公司；蛋白酶K（14.88 U/mg）：上海士锋生物科技有限公司。

1.2试验仪器

BANTE930型精密pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SII立式高压蒸汽灭菌锅：济南思卓医疗器械有限公司；DNP-9272A恒温培养箱：常州诺基仪器有限公司；A1301049低温高速离心机：上海艾测电子科技有限公司；生物洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司。

2　方法

2.1乳酸杆菌人工胃肠液耐受性实验

根据Huang等［10］的方法配置人工胃液和人工肠液，人工胃液中含有3 g/L的胃蛋白酶、5 g/L生理盐水，调整pH为2.0，人工肠液中含有1 g/L的胰蛋白酶、0.3 g/L牛胆盐、5 g/L生理盐水，调整pH为8.0。乳酸杆菌在MRS液体培养基37℃条件下过夜培养，离心（6 000 r/min，8 min，4℃）得到菌体，用PBS缓冲液清洗菌体两次，将菌体分别重悬在人工胃液和肠液中，37℃保持2 h，最后利用MRS培养基进行平板计数。

2.2具有优良拮抗沙门氏菌的乳酸杆菌的复筛

2016年全旗共抽检产地蔬菜1293个样品、食用菌样品39个、畜产品样品129个，合格率均为100%。2017年共抽检产地蔬菜2516个样品、畜产品42个样品，合格率均为100%，瘦肉精共抽检340个活畜尿样，检测结果未发现疑似阳性案例，饲料共抽检57个样品，合格率为98.2%。群众一日三餐担忧和害怕农畜产品不能吃、不敢吃的心理已基本化解和消除。

将100 μL的沙门氏菌菌液接种到LB液体培养基中，37℃培养18 h，然后在琼脂培养基中三区划线。挑取上述微生物的单菌落，在LB培养基中活化，离心取悬浮液，调节浓度在107CFU/mL。利用相同的方法，利用MRS培养基调节乳酸杆菌的浓度为107CFU/mL，并加入10%（体积比）的上述浓度的乳酸杆菌在沙门氏菌中，上述的混合菌液在37℃下培养48 h，分别在0、24 h和48 h时在XLD培养基上对沙门氏菌进行平板计数。

2.3乳酸杆菌抑菌物质的初步分析

根据王刚等［11］的报道配置乳酸杆菌上清液，在上清液中分别加入蛋白酶K（200 μg/mL）、胰蛋白酶（200 μg/mL）和过氧化氢酶（1 mg/mL），均在37℃下保持1 h，采用牛津杯法，吸取250 μL108 CFU/mL的沙门氏菌悬浮液涂布在琼脂培养基中，菌液干燥后加入100 μL乳酸杆菌上清液，在37℃下培养48 h，测量抑菌圈的直径。

2.4pH对抑菌效果的影响

调整乳酸杆菌上清液pH至6.5，并以原始乳酸杆菌上清液为对照，8株乳酸杆菌上清液pH范围为3.0～3.8。分别测定上述上清液的抑菌能力，方法如2.3所示。

2.5抑菌物质热稳定性实验

将供试乳酸杆菌上清液在100℃条件中保持30min，测定上清液的抑菌能力，测定方法如2.3。

所有测定试验都重复3次，利用SPSS17.0软件对试验数据进行分析，选择Tukey's检验，当P＜0.05时可视为统计学意义上差异显著。

3　结果与分析

3.1乳酸杆菌对人工胃液和人工肠液的耐受能力为了分析8株乳酸杆菌对胃液和肠液的耐受能力，本试验利用人工胃液和人工肠液模拟了人体的胃肠环境，并记录8株乳酸杆菌的变化，结果如表2所示。

表2　乳酸杆菌在人工胃液和人工肠液中的耐受性分析Table 2　Tolerance analysis of Lactobacillus strains in simulated gastric and simulated small intestinal juices

由表2可知，8株乳酸杆菌在人工胃液（pH=2.0）中2 h后平均下降了2.07个数量级（P＜0.05），除了L. rhamnosus和L.bulgaricus以外，其他的6株乳酸杆菌经过人工胃液的作用菌落总数均能达到107CFU/mL；在人工肠液（pH=8.0）中保持2 h后，L.rhamnosus和L. bulgaricus的数量发生了显著的减少（P＜0.05），分别降低了0.8和0.81个数量级，其他6株乳酸杆菌在人工肠液的作用下没有发生明显的变化。一般情况下乳酸杆菌在肠道中发挥作用，且107CFU/mL以上的活菌数才能发挥其益生作用。因此，在8株乳酸杆菌中L. rhamnosus和L.bulgaricus对人工胃液和人工肠液的耐受能力较弱，不宜进行进一步的筛选。

3.2具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌的复筛

将10%（体积比）107CFU/mL的经过人工胃肠液处理的乳酸杆菌与相同浓度的沙门氏菌共同培养，并以添加相同体积LB培养基的沙门氏菌做为对照，复筛出具有优良拮抗沙门氏菌能力的乳酸杆菌，结果如图1所示。

由图1可知，与对照组相比，6株乳酸杆菌都对沙门氏菌起到了抑制作用，并且这种拮抗作用随着时间的延长而加强，其中编号为3的L.plantarum对沙门氏菌的拮抗作用最强，且3株植物乳杆菌的抑菌能力也都高于其他3株乳酸杆菌，这说明植物乳杆菌对沙门氏菌的拮抗能力总体较强。

3.3乳酸杆菌抑菌物质的初步分析

利用蛋白酶K、胰蛋白酶和过氧化氢酶处理乳酸杆菌的上清液，之后利用牛津杯法测定乳酸杆菌的抑菌能力，结果如表3所示。

图1　乳酸杆菌活菌与S.typhimurium共培养下S.typhimurium的活菌数Fig.1 The live cell counts of S.typhimurium in the co-culture with Lactobacillus

由表3可知，经过上述3种酶处理后的乳酸杆菌上清液和未处理的上清液相比，沙门氏菌抑菌圈的直径都有所的减小，其中编号为1、2和3的植物乳杆菌的抑菌圈直径显著减少（P＜0.05），其他乳酸杆菌作用的沙门氏菌抑菌圈减小不显著（P＞0.05）。结合3.2中的结果，植物乳杆菌对沙门氏菌的抑菌活力较强，然而酶作用后上清液的抑菌能力显著下降，这说明蛋白酶K、胰蛋白酶和过氧化氢酶破坏了上清液中的抑菌物质，因此这种抑菌物质中应该包含细菌素和过氧化氢。此外经过酶左右后抑菌能力虽然降低但是并没有完全消失，这说明应该还存在其他的抑菌物质。

3.4pH值和热处理对抑菌效果的影响

通过调节乳酸杆菌上清液pH值和在100℃中保持30 min的方式，分析pH值和热处理对乳酸杆菌抑菌能力的影响，结果如表4所示。由表4可知，未处理的乳酸杆菌上清液的pH在3.0～3.8，当调节pH为6.5后，乳酸杆菌的抑菌能力明显下降（P＜0.05），上述结果与之前的报道相似，分析其原因，是因为较低的pH下上清液中的有机酸处于一个未解离的状态更有利于进入沙门氏菌细胞内发挥抑菌作用［12］。这也说明在6株乳酸杆菌中的抑菌物质中都含有有机酸。同时，热稳定试验结果表明，在6株乳酸杆菌中1、2、3号植物杆菌的抑菌物质的热稳定性较好，其他3株乳酸杆菌在100℃，30 min条件下抑菌物质的抑菌活性显著降低（P＜0.05）。

表3　蛋白酶K、胰蛋白酶和过氧化氢酶对乳酸杆菌抑菌效果的影响Table 3　Effects of proteinase K，trypsin and catalase on antibacterial effect of Lactobacillus

表4pH值和热处理对乳酸杆菌抑菌效果的影响Table 4　Effects of pH value and heat treatment on antibacterial effect of Lactobacillus

4　结论

8株乳酸杆菌中，3号植物乳杆菌对沙门氏菌的拮抗能力最强，且具有耐受人工胃液和人工肠液的能力。3号植物乳杆菌上清液中的抑菌物质包含了细菌素、有机酸和过氧化氢，且上述抑菌物质的混合物具有一定的热稳定性。

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Study of Lactobacillus Strains with Antagonistic Activity against Salmonella

ZHANG Hui1，QIAN Guo-qiang1，*，LI Bin2
（1.Department of Nursing，Huanghuai College，Zhumadian 463000，Henan，China；2.Department of Biological Engineering，Huanghuai College，Zhumadian 463000，Henan，China）

Salmonella is one of the common foodborne pathogenic bacteria.Some studies had reported that Lactobacillus could effectively inhibit some pathogenic bacteria，however，the reports of Lactobacillus strains with antagonistic activity against Salmonella were not common.A Lactobacillus strain with good antagonistic activity against Salmonella was selected，and the characteristics of antibacterial substance was revealed.Results showed that the No.3 L.plantarum had a stronger inhibition to Salmonella.The antibacterial substances contained bacteriocins，organic acid and hydrogen peroxide.In addition，the antibacterial substances of Lactobacillus also had strong thermal stability.

Salmonella；Lactobacillus；antagonistic activity；antibacterial substance

2016-05-12

2014河南省教育厅重点项目（14B180006）；2012年河南省科技发展项目（122102310264）；黄淮学院青年骨干教师资助计划（0700.16.01.1140）

张卉（1981—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：生物学及应用、微生物学。