伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA的克隆与分析

黄伟，冯作山，张培岭，白羽嘉（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA的克隆与分析

黄伟，冯作山，张培岭，白羽嘉*
（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

以“卡拉克塞”伽师瓜为试验材料，采用甜瓜基因组辅助设计超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）基因扩增引物。以伽师瓜cDNA为模板克隆超氧化物歧化酶基因CDS区序列，获得三条超氧化物歧化酶基因序列，分别命名为JSGSOD1（Genebank登录号KT160023）、JSGSOD2（Genebank登录号KT160024）和JSGSOD3（Genebank登录号KT160025），序列长度分别为987bp、804bp和459 bp。伽师瓜SOD与甜瓜SOD具有高度的同源性。JSGSOD1含CuSOD结构域，JSGSOD2含FeSOD家族结构域，而JSGSOD3含Cu/ZnSOD家族结构域。并利用相关软件对其理化性质分析和亚细胞器定位进行了预测分析。

伽师瓜；超氧化物歧化酶；克隆；分析

伽师瓜属于厚皮甜瓜（Cucumis melo L.）变种，为葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属（Cucumic Linn）甜瓜亚属（Melo Jeffrey）［1］。因产地在伽师县而得名，其栽培历史悠久，当地独特的气候和水土条件赋予了伽师瓜含糖量高，风味浓郁，瓜肉清脆爽口等特点，且伽师瓜较耐贮藏，果实抗病性强，采用传统的窖藏方式其贮藏期可达6个月之久。果实在贮藏过程中会产生和积累活性氧，活性氧对病原微生物产生抑制和杀灭作用，提高果实抗病性；但活性氧也会对植物细胞膜产生损害，引起采后衰老，从而抗病性降低［2］。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是植物体内重要的活性氧清除剂，可调节活性氧的平衡，SOD的种类、活性和作用方式与耐藏性和抗病性密切相关［3］。

1969年，因Mccord等揭示了其催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以将其命名为超氧化物歧化酶［4］。SOD按其所含金属辅基的不同分为以下四种类型：（1）Cu/Zn-SOD，主要存在于细胞质、叶绿体和过氧化物酶体中，是SOD中含量最丰富的一种［5］，且目前对其研究较多［6-7］；（2）Mn-SOD，主要存在于真核生物的线粒体中［8］；（3）Fe-SOD，Fe金属辅基的SOD，主要存在于叶绿体中［9］；（4）Ni-SOD，Ni金属作为辅基的SOD［10］。不同的SOD在植物抗病性、耐藏性和抗逆反应中起着不同的作用。伽师瓜的耐藏性和抗病性很强，伽师瓜果实采后SOD的研究主要集中在SOD酶活性与抗病性、贮藏期的关系上［11-13］，而有关SOD基因与其抗病机制的关系研究较少，马伟荣对伽师瓜Cu/ZnSOD进行了克隆并研究了SOD酶活性与表达量之间的关系［13］。另外，目前对甜瓜基因的克隆主要采用同源克隆［13］和RACE［14］的方法，还未见到以甜瓜基因组辅助设计引物得到特异性PCR产物的报道。

本文以新疆伽师瓜为试验材料，通过甜瓜基因组辅助设计引物，克隆SOD基因cDNA，预测分析其结构与功能，为进一步了解伽师瓜SOD基因的生物学功能奠定基础；该研究也为从基因表达的角度上揭示伽师瓜贮藏抗病过程中活性氧（如SOD）的调控机制提供前期研究基础；更对甜瓜抗病育种具有重要的价值。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

“卡拉克塞”伽师瓜，于2014年9月采自新疆伽师县英买里乡。

RNAplant Plus植物总RNA提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；Thermo Scientific Rvertaid first Strand cDNA Synthesis Kit：美国赛默飞世尔科技；LA Taq DNA聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司；DNA Marker（GM335）、6×DNA Loading Dye、4S Red Plus Nucleic Acid Stain（NB6695）、Tris-base：生工生物工程（上海）有限公司；琼脂糖，西班牙Biowest公司；冰乙酸、乙二胺四乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2主要仪器设备

JH-DS型净化工作台：上海鸿都电子科技有限公司；D2012离心机，大龙医疗设备（上海）有限公司；DW-FL90低温冰箱：中科美菱低温科技有限责任公司；T-100型PCR仪、PowerPac Universal型电泳仪：美国Bio-rad公司；Heraeus Biofuge Primo R型低温离心机、美国赛默飞世尔科技；WD-9403C型紫外仪：北京市六一仪器厂；移液器：大龙医疗设备（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA克隆的引物设计

参照甜瓜基因组（http：//melonomics.net）中的SOD基因，分别以MELO3C014007T1、MELO3C015351T2和MELO3C015374T2为模板，使用ORF Finder和Primer Premier 6.0设计伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA扩增引物，结果见表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1伽师瓜SOD基因cDNA的PCR扩增引物Table 1　Primer sequences for PCR amplification of superoxide dismutas cDNA of Jiashi melon

1.2.2伽师瓜果肉总RNA的提取

将伽师瓜果肉用液氮快速研磨至粉末状。按植物总RNA抽提试剂盒方法提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

1.2.3反转录cDNA

按照反转录cDNA试剂盒Thermo Rvertaid first Strand cDNA Synthesis说明书进行，产物经分装后保存于-80℃低温冰箱中。

1.2.4PCR反应

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体系总体积为100μL，包括：cDNA模板4μL，上下游引物（10 μM）各2μL，dNTP（10mM）0.8μL，2×GC Buffer I 50μL，ddH2O 40.4μL，LA TaqDNA聚合酶（5U/ μL）0.8μL。

PCR反应条件为：94℃5min→94℃30s、Tm℃30s→ 72℃1 min（共33个循环）→72℃，10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5载体克隆测序

电泳后将PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司委托进行载体克隆测序。

2　结果与分析

2.1伽师瓜果肉总RNA提取结果

伽师瓜果肉总RNA提取结果见图1，由图1可知，28s和18s条带清晰，可进行下一步反转录cDNA实验。

2.2伽师瓜超氧化物歧化酶CDS序列的克隆

以伽师瓜果肉cDNA为模板，克隆伽师瓜SOD编码蛋白序列，伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA PCR扩增结果见图2，分别得到长度约为987 bp、804 bp和515 bp的DNA片段。采用DNAMAN软件将测序获得的序列进行拼接，得到伽师瓜超氧化物歧化酶JSGSOD CDS序列；然后使用ORF finder软件在线分析其CDS序列，结果见图3、图4和图5，发现三个SOD的CDS序列包含起始密码子和终止密码子，为全长的开放阅读框，其长度分别为987 bp、804 bp和459 bp，而编码蛋白质长度分别为328个、267个和152个氨基酸。将序列提交至Genebank，获得登录号，分别为KT160023、KT160024和KT160023。

图1 伽师瓜果肉RNA提取结果Fig.1　The RNA isolated result of Jiashi melon

图2　伽师瓜超氧化物歧化酶cDNA PCR扩增结果Fig.2　The results of Jiashi melon SOD cDNA PCR amplification

图3　JSGSOD1 CDS的ORF分析Fig.3　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD1 CDS

图4JSGSOD2 CDS的ORF分析Fig.4　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD2 CDS

图5JSGSOD3 CDS的ORF分析Fig.5　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD3 CDS

2.3伽师瓜超氧化物歧化酶CDS序列的分析

2.3.1系统进化树分析

采用NCBI在线搜索伽师瓜三个SOD同源性较高的核苷酸序列并下载，采用MEGA 6.05构建核苷酸序列系统进化树，结果见图6。

图6 超氧化物歧化酶CDS区核苷酸序列的系统进化树Fig.6　Phylogenetic tree from nucleotide CDS sequences of different species of Superoxide Dismutase

由图6得知，超氧化物歧化酶基因可分为两大类，一类是Cu/ZnSOD，另一类是FeSOD。伽师瓜的三个SOD均与甜瓜SOD聚为一类，且高度同源。与黄瓜（Cucumis sativus）、笋瓜（Cucurbita maxima）和南瓜（Cucurbita moschata）等其他物种的同源关系较远。JSGSOD1与甜瓜CuSOD聚为一类，表明只特异性的结合Cu2+；而JSGSOD3则是Cu/ZnSOD，能结合Cu2+和Zn2+。

2.3.2JSGSOD蛋白部分理化性质预测分析

使用蛋白质分析软件Protparam对伽师瓜的三个SOD理论等电点等理化性质进行预测分析。JSGSOD2的等电点最高，为7.14，预测为碱性蛋白质；而JSGSOD1和JSGSOD3等电点都小于7，分别为5.16和5.28，预测是酸性蛋白质。伽师瓜 3个 SOD中JSGSOD2的不稳定指数大于40，为不稳定蛋白；而JSGSOD1和JSGSOD3为稳定蛋白。另外，JSGSOD1、JSGSOD2和JSGSOD3的亲水性平均数都为负数，预测均为亲水性蛋白。

2.3.3JSGSOD保守结构域预测分析

使用NCBI在线CDS预测分析伽师瓜3个SOD的氨基酸保守结构域结果见图7、图8和图9。

图7　JSGSOD1的保守结构域预测分析Fig.7　Predictive analysis of JSGSOD1 conserved domains

图8　JSGSOD2的保守结构域预测分析Fig.8　Predictive analysis of JSGSOD2 conserved domains

图9　JSGSOD3的保守结构域预测分析Fig.9　Predictive analysis of JSGSOD3 conserved domains

JSGSOD1具有Cu/ZnSOD超家族保守结构域，且有典型的4个Cu2+结合位点，分别与Ser213、Asn215、IIe230和Trl279配位。而活性位点在Ser213、Asn215、IIe230、Asp245和Trl279。只含Cu2+的SOD具有和Cu/ ZnSOD类似的催化机理。根据结果分析JSGSOD2具有FeSOD家族保守结构域。JSGSOD3属于Cu/ZnSOD家族，具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点。Cu2+分别与His45、His47、His62和His119配位，而Zn2+则与His62、His70、His79和Asp82配位。活性位点为His45、His47、His62、His79、Asp82和His119。Cu2+结合位点、Zn2+结合位点共同结合His62形成“咪唑桥”结构。其催化活性中心在Cu部位上，通过Cu2+产生氧化还原反应催化超氧阴离子自由基。

2.3.4JSGSOD亚细胞器定位分析

使用ProtComp 9.0对伽师瓜3个SOD进行了亚细胞器定位预测分析，结果见表2。

表2JSGSOD的亚细胞器定位预测分析Table 2　Predictive analysis of JSGSOD subcellular organelles

从分析结果可以看出，JSGSOD1和JSGSOD3预测亚细胞器位置位于细胞质的可能性很大，表明这两个蛋白在细胞质内发挥作用，而JSGSOD2的亚细胞器位置预测在叶绿体。

3　讨论与结论

在受到病原菌侵染等生物胁迫时，植物体内的自由基增加，抗氧化能力下降。而超氧化物歧化酶作为植物清除自由基的主要防线，可将寄主的活性氧水平维持在正常范围内。研究表明Cu/ZnSOD在植物抵抗逆境（如低温、病虫害、高盐等）的过程中起到重要的作用［15］。为了保证准确性，文中采用了两种软件对3个SOD的氨基酸序列进行信号肽的预测，结果发现两者的预测一致。对保守结构域的预测中发现JSGSOD3铜锌离子结合位点在已报道的Cu/ZnSOD中是非常保守的［16-17］。经过预测伽师瓜SOD亚细胞器的位置在细胞质和叶绿体，符合文献中相关的报道［18］，表明亚细胞器的位置与SOD的类型有关。尽管生物信息学预测不能保证其准确性，但是在无法用实验来确定其结构和功能时，预测蛋白质的结构和功能就成为指导研究者下一步试验的必要任务。从伽师瓜中克隆超氧化物歧化酶基因，丰富了其基因的多样性，但对伽师瓜贮藏过程中SOD表达情况及预测中的亚细胞器定位等还有待进一步的研究。

SOD是活性氧清除酶的关键酶，活性氧代谢与与甜瓜的抗病性密切相关，基因编码蛋白质（酶），酶调控着果实的生理活动，SOD调控活性氧代谢。伽师瓜为新疆特有甜瓜品种，其耐藏性强，品质好，可作为母本进行杂交育种，但国内外采用伽师瓜为母本进行育种的较少。因此该研究将有助于推广以伽师瓜为母本进行育种，改善甜瓜在贮藏过程中的抗病能力，达到延长贮运期的目的。

本文以新疆伽师瓜cDNA为模板，通过甜瓜基因组辅助设计引物，载体克隆测序得到3个SOD序列，其CDS序列长度分别为987 bp、804 bp和459 bp。经过预测分析JSGSOD1和JSGSOD3属Cu/ZnSOD，而JSGSOD2属FeSOD。结果表明采用甜瓜基因组辅助设计引物克隆cDNA是可行的，为甜瓜基因方面的研究提供思路；对其进行的理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞器定位和功能预测分析能帮助我们了解它们的结构和功能，而这些对指导甜瓜抗病性育种和转基因作物都具有重要的应用价值。

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Cloning and Analysis of Jiashi Melon Superoxide Dismutase cDNA

HUANG Wei，FENG Zuo-shan，ZHANG Pei-ling，BAI Yu-jia*
（College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultual University，Urumuqi 830052，Xinjiang，China）

Melon genome was used to design superoxide dismutase（SOD）gene amplification primers.Three superoxide dismutase gene sequences obtained from“kalakesai”Jiashi melon cDNA were named as JSGSOD1 （Genebank accession number：KT160023），JSGSOD2（Genebank accession number：KT160024）and JSGSOD3 （Genebank accession number：KT160025），sequence lengths were 987 bp，804 bp and 459 bp，respectively. Jiashi melon SOD and melon SOD had a high degree of homology.JSGSOD1 contained CuSOD family domain，JSGSOD2 contained FeSOD family domain，JSGSOD3 contained Cu/ZnSOD family domain.The paper also analyzed its physical and chemical properties and subcellular localization analysis with relevant software.

Jiashi melon；superoxide dismutase；cloning；analysis

2015-09-25

国家自然基金资助项目（31460413）

黄伟（1991—），男（汉），硕士研究生在读，研究方向：食品科学。