食管癌易感基因C20orf54的生物信息学分析*

黄志刚，洪秋娜，陈婷婷，李戈楠，何　臻，伦嘉欣，林　婉，赖玉仙，杨　威，邓俏莲

(广东医学院公共卫生学院东莞市环境医学重点实验室，广东东莞 523808)



食管癌易感基因C20orf54的生物信息学分析*

黄志刚，洪秋娜#，陈婷婷，李戈楠，何臻，伦嘉欣，林婉，赖玉仙，杨威，邓俏莲

(广东医学院公共卫生学院东莞市环境医学重点实验室，广东东莞 523808)

目的利用生物信息学方法对食管癌易感新基因C20orf54进行特征分析和功能预测，以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示。方法应用Blat、Blast、ProtParam、SOPMA、ScanProsite、SignalP4.1、TMHMM、PSORT和UniGene等软件或数据库,进行染色体定位、序列的相似性比较、理化性质、二级结构、亚细胞定位、功能位点识别。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，验证C20orf54基因在食管癌细胞和鼻咽癌细胞中的表达情况。结果C20orf54基因进化保守，蛋白质不稳定，具有疏水性，定位于细胞膜的可能性最高，序列中预测有蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点及N-豆蔻酰化位点。二级结构主要是α螺旋和无规则卷曲。C20orf54基因可在食管癌细胞和鼻咽癌细胞中表达。结论人类C20orf54蛋白是定位于细胞膜上的不稳定疏水蛋白，可能在体内参与多种生物学过程，但可能并不是在食管癌组织特异表达的分子标志。

食管肿瘤；生物信息学；C20orf54

食管鳞状细胞癌(简称食管癌)是全世界十大恶性肿瘤之一，具有特定区域高发的特点。世界上食管癌发病率和病死率最高的地区集中在我国的河南、河北和山西三省交界的太行山地区，食管癌仍是这些地区肿瘤相关死亡的主要原因[1]。尽管普遍认为食管癌的发生是由环境、遗传等多种因素综合作用的结果，但其致癌的分子机制至今未明。新近的全基因组关联研究(GWAS)在鉴定复杂性疾病易感基因方面取得的成就，为揭示食管癌的发病机制提供了重要证据。以我国人群为基础的食管癌GWAS发现，核黄素转运基因又称C20orf54基因的rs13042395位点是食管癌的易感位点，C20orf54成为新的食管癌易感基因而备受研究者重视[2]。

目前已有多篇文献报道了C20orf54基因的功能性遗传变异与食管癌的发生有关[3-5]，但也有两项独立的研究认为C20orf54基因与食管癌无关[6-7]。因此，C20orf54基因的生物学功能是什么，其在食管癌的发生、发展过程中发挥什么作用等问题，亟待进一步研究解决。本研究利用生物信息学方法对C20orf54基因及其编码的蛋白进行了分析和功能预测，并观察C20orf54基因在不同上皮细胞内的表达情况，为进一步深入研究C20orf54基因的生物学功能提供参考依据。

1　材料与方法

1.1基因组定位及外显子分析用UCSC Genome Bioinformatics 的Blat数据库进行基因组定位及外显子分析(http:// genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。

1.2序列比对利用NCBI的Blastn程序进行C20orf54基因的核苷酸序列同源性分析；用BlastP程序进行氨基酸同源性对比(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.3理化性质分析利用ExPASy 的ProtParam Tool 软件(http://web.expasy.org/protparam)预测等电点、分子量、疏水性、电荷分布等。

1.4蛋白质结构预测利用SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)分析C20orf54蛋白的二级结构；利用ExPASy 的ScanProsite tool工具(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)预测蛋白质的功能性位点；信号肽剪切位点利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测；TMHMM程序预测跨膜信息(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；保守结构域及其功能用NCBI/CDD预测。

1.5亚细胞定位分析利用PSORT (http://psort.hgc.jp/form2.html) 进行亚细胞定位预测。

1.6RT-PCR扩增C20orf54基因编码区Trizol法提取食管癌细胞(ECA109)、鼻咽癌细胞(CNE-2Z)总RNA，按逆转录试剂盒(QIAGEN)操作步骤进行逆转录。以cDNA为模板，扩增C20orf54 基因编码区序列，上游引物：5′-ATG GCC TTC CTG ATG CAC C-3′，下游引物：5′-CTA GGC TGG ACA GTG CAG AT-3′。扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s,58 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将扩增产物送上海立菲生物技术有限公司(广州分公司)测序，并将序列登录GenBank数据库。

2　结　　果

2.1基因组定位及外显子分析将C20orf54基因序列(NM_033409)与人类基因组草图库进行比对,该cDNA 序列定位于20号染色体740,724～749,228区域(20p13)，基因组跨越8,505 bp。外显子分析发现，C20orf54基因由5个外显子和4个内含子所组成，内含子和外显子交界区均符合AG-GT规则。

2.2序列比对结果经BLASTn在nr核苷酸序列数据库在线同源性分析C20orf54基因序列，发现人与大猩猩、长臂猿、恒河猴等灵长类哺乳动物的相似性在95%以上，其中大猩猩最高达98%；而人与狼犬、家猫、虎鲸及小鼠等物种的相似性分别为85%、85%、85%和83%。经对C20orf54的多物种氨基酸序列相似性比较发现，人与大猩猩、黑长臂猿的相似性最高达到99%，与松鼠猴、狨毛猴的相似性为94%，与家豚鼠、狼犬、海豚、小鼠和青将鱼的相似性分别为84%、82%、81%、74%和47%。C20orf54蛋白的氨基酸组成在脊椎动物中保守性较高。

2.3C20orf54蛋白的理化性质C20orf54基因编码的蛋白质氨基酸长度为469 aa，相对分子质量为50 805.1，理论等电点为5.46，pH7.0时带负电荷(-10.947)。该蛋白质的半衰期在哺乳动物网织红细胞中为30 h，在酵母体内超过20 h，大肠杆菌体内可超过10 h；不稳定指数为43.92(>40为不稳定)，属于不稳定蛋白质；脂肪指数为119.06，总体平均亲水值为0.882，属于疏水蛋白质。

2.4蛋白质结构预测及亚细胞定位分析C20orf54蛋白二级结构预测发现，含α螺旋(Hh)36.46%，β折叠(Tt)5.12%，延伸链(Ee)和无规则卷曲(Cc)分别占15.35%、43.07%。 ScanProsite tool工具寻找蛋白质的功能性位点，结果发现在该蛋白质氨基酸序列中存在1个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-糖基化位点及10个N-豆蔻酰化位点，未发现其他基序及保守结构域存在。TMHMM程序预测C20orf54蛋白可能存在11个跨膜区域，N末端在膜内的概率为99.621%。亚细胞定位分析认为，C20orf54蛋白在细胞膜表达的可能性最高(73.9%)，其次为内质网(21.7%)和线粒体(4.3%)。而SignalP4.1未预测出信号肽剪切位点。

2.5RT-PCR结果本研究选择食管癌(ECA109)和鼻咽癌(CNE-2Z)两种细胞株，抽提细胞总RNA，进行RT-PCR，发现均可扩增出约1 400 bp的C20orf54基因编码区片段。琼脂糖凝胶电泳结果见图1、2。测序证实扩增片段与C20orf54基因编码区序列一致。

1：LD2000 Marker；2：扩增产物。

图1食管癌细胞ECA109扩增结果

1：LD2000 Marker；2：扩增产物。

图2鼻咽癌细胞CNE-2Z扩增结果

3　讨　　论

食管癌GWAS发现，C20orf54基因rs13042395位点的遗传变异与食管癌有关，C20orf54基因作为新的食管癌易感基因成为研究热门[2]。C20orf54是人类核黄素转运基因，该基因定位于20p13，其编码产物为核黄素转运蛋白。目前，人类核黄素转运蛋白的生物学功能尚未阐明，因其与鼠核黄素转运蛋白有83%的相似性，所以推测人类核黄素转运蛋白与鼠相似，在小肠和结肠中高表达，在肠组织对核黄素的吸收中发挥重要作用[8]。

利用Blast程序在多个物种内发现与人C20orf54蛋白相似的序列,其相似度从高等灵长类动物大猩猩、类人猿到海洋哺乳动物海豚、从啮齿类动物小鼠到低等脊椎动物青将鱼等依次降低。说明人C20orf54基因进化上相对保守，其可能参与基本生物学过程。对C20orf54蛋白质的二级结构预测发现，其肽链上α螺旋和无规则卷曲水平较高，表明该蛋白具有较好的可塑性。理化性质分析发现，C20orf54蛋白是不稳定的疏水蛋白质，可能定位在细胞膜上(73.9%)，发挥其多种生物学作用。C20orf54蛋白可能存在11个跨膜区域，而跨膜结构多构成受体、通道，执行信号传导等重要功能[9-10]。

对C20orf54蛋白进行功能性位点分析发现，其氨基酸序列中存在蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点及N-豆蔻酰化位点。蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点是信号传导调控中的常见分子结构，在细胞增殖及细胞周期中有着广泛的调节作用[11]。N-糖基化位点是蛋白质糖基化修饰的识别位点，蛋白质的糖基化修饰使糖链与糖结合蛋白相互作用，参与众多生理或病理过程，也可以作为微生物和有毒物质的结合位点。蛋白质的糖基化修饰是生物体调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性的一种普遍的翻译后方式[12]。而豆蔻酰化位点可参与细胞生长发育、信号传导和肿瘤发生等重要生理过程。由于蛋白质结构特异性识别相关分子是其行使功能的关键，故该蛋白可能通过磷酸化、糖基化及豆蔻酰化而发挥多种重要的生物学作用。

本研究发现，食管癌(ECA109)和鼻咽癌(CNE-2Z)均可扩增出约1 400 bp的片段，经测序证实与C20orf54基因编码区序列一致，说明C20orf54基因在食管癌及鼻咽癌细胞中均是有表达，C20orf54基因可能不是在食管癌组织特异表达的分子标志。

在发现C20orf54基因与食管癌的关系之前，已有多篇报道认为，C20orf54基因突变与Brown-Vialetto-Van Laere综合征(BVVLS)有关。BVVLS是一种罕见的以进行性桥延麻痹伴有耳聋为特点的神经障碍疾病。目前认为，C20orf54基因突变是导致BVVLS发生的重要致病因素，尽管其具体致病机制尚不清楚[13-16]。可见，人类C20orf54基因可能在体内多种生理、病理过程中发挥作用，有必要对其进行更深入的研究。本文通过生物信息学分析初步揭示了人类食管癌新易感基因C20orf54及其编码产物的基本特性，为进一步开展C20orf54基因的功能和相关分子机制研究奠定了基础。

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东莞市社会科技发展项目(2013108101052)；广东省大学生创新创业训练项目(2KY12023)。作者简介：黄志刚(1971-)，副教授，博士，主要从事肿瘤流行病学研究。#并列第一作者。

·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.035

R735.1

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1671-8348(2016)22-3121-03

2016-02-08

2016-03-15)