乙醛对人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响研究

张林霞，李晓东

(河北省唐山市工人医院：1.老年病三科；2.肾内科　063000)



乙醛对人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响研究

张林霞1，李晓东2△

(河北省唐山市工人医院：1.老年病三科；2.肾内科063000)

目的通过研究乙醛对体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响，以探讨乙醛导致肾小管间质纤维化的机制。方法选取人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养于含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。以不同浓度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2细胞24 h。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HK-2细胞中TGF-β1的基因表达；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中TGF-β1的蛋白表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平。结果RT-PCR和Western blot结果显示，乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞中TGF-β1基因和蛋白的表达；ELISA法结果显示，乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞培养上清液中TGF-β1的水平。结论乙醛能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1，从而促进肾小管间质纤维化的进展。

乙醛；肾小管上皮细胞；转化生长因子-β1；肾小管间质纤维化

众所周知，长期大量饮酒会导致肝脏损害，严重时可造成酒精性肝硬化。机体摄入大量的乙醇后，约90%在肝脏乙醇脱氢酶的作用下转化为乙醛，并进入血液循环。肾脏是仅次于肝脏的乙醇排泄器官。乙醇及其代谢产物通过肾脏排泄到尿中，尿中乙醇及代谢产物的水平高于肝脏及血液中的水平[1]。因此，长期过量饮酒也可导致乙醇性肾损害[2]。动物实验表明，乙醇性肾损伤病理表现为肾小管间质的炎症改变及纤维化[3]，但其作用机制目前尚不清楚。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公认的促进肾小管间质纤维化的关键性的细胞因子[4]。本实验通过研究乙醇的代谢产物乙醛对体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响，为明确乙醇导致肾小管间质纤维化的发病机制提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞株)由唐山市工人医院中心实验室保存。乙醛购自天津鼎盛鑫化工有限公司，逆转录试剂盒、PCR试剂盒为美国Promega公司产品，PCR引物由上海生工合成。兔抗人TGF-β1多克隆抗体、小鼠抗人Tubulin单克隆抗体购自美国Santa Cruze公司。碱性磷酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥公司，BCIP/NBP显色试剂盒购自上海碧云天。TGF-β1ELISA试剂盒购自美国R & D公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HK-2细胞培养于含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。实验前换成无血清培养液同步化24 h。参照有关文献[5]，分别加入含终浓度为0、50、100、200、400 μmol/L乙醛的培养液，继续培养24 h。收集细胞或培养上清液进行实验。

1.2.2逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TGF-β1基因表达应用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化收集细胞，应用TRIzol试剂提取细胞总RNA，测定A260/A280=1.8～2.0，计算其水平。取1 μg总RNA反转录为cDNA。引物设计参考有关文献[6]。TGF-β1(306 bp)：上游引物5′- AGG TCA CCC GCG TGC TAA T -3′，下游引物5′- TCA ACC ACT GCC GCA CAA CT -3′ 。β-actin (202 bp)：上游引物5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游引物5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′ 。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28个循环后，72 ℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在Bio-Rad凝胶成像系统中观察结果，应用Bio-Rad联机专用软件分析电泳条带灰度值。

1.2.3蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β1蛋白表达应用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化收集细胞，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 g/min离心5 min提取总蛋白。BCA法检测蛋白水平。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人TGF-β1多克隆抗体(1∶800)和小鼠抗人Tubulin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜。洗膜后分别加入碱性磷酶标记的山羊抗兔(1∶1 000)、山羊抗小鼠二抗(1∶1 000)，BCIP/NBT显色。应用Image J图像分析软件分析TGF-β1及Tubulin条带的灰度值。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平收集细胞培养上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平。

2　结　　果

2.1乙醛对细胞中TGF-β1基因表达的影响正常HK-2细胞中有少量的TGF-β1的基因表达，50 μmol/L乙醛刺激HK-2细胞24 h后TGF-β1的基因表达较对照组比较明显增强(P<0.05)；随着乙醛浓度的升高，TGF-β1的基因表达量明显增加，并具有一定的浓度依赖性。见图1。

图1　乙醛对TGF-β1基因表达的影响

2.2乙醛对细胞中TGF-β1蛋白表达的影响正常HK-2细胞中有少量的TGF-β1的蛋白表达，50 μmol/L乙醛刺激HK-2细胞24 h后TGF-β1的蛋白表达量没有显著增加(P>0.05)，但100 μmol/L乙醛刺激HK-2细胞24 h后TGF-β1的蛋白表达较对照组比较明显增加(P<0.05)；随着乙醛浓度的升高，TGF-β1的蛋白表达量明显增加，具有一定的浓度依赖性。见图2。

2.3乙醛对细胞培养上清液中TGF-β1的水平的影响正常HK-2细胞培养上清液中TGF-β1的水平很低(216.42±60.75)μg/L，100 μmol/L乙醛刺激HK-2细胞24 h后培养上清液中TGF-β1的水平开始增加(325.72±74.52)μg/L，较对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；随着乙醛浓度的升高，培养上清液中TGF-β1的水平明显增加，分别为(515.72±49.08)μg/L、(585.08±78.03)μg/L，具有一定的浓度依赖性。

图2　乙醛对TGF-β1蛋白表达的影响

3　讨　　论

长期大量饮酒可导致全身多脏器损害。机体摄入乙醇后约90%在肝脏代谢，摄入的乙醇在肝脏乙醇脱氢酶的作用下转化为乙醛并进入血液循环。肝脏是乙醇代谢的主要器官，也是最容易损伤的器官。乙醛能够刺激肝星状细胞活化、增殖，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原及TGF-β1的表达明显增加，是形成乙醇性肝硬化的中心环节[7-8]。由于肾脏的血供丰富，过量饮酒后，超过肝脏的代谢能力，容易导致过量的乙醇、乙醛在肾脏蓄积，从而引起肾脏损害。乙醇灌胃导致的大鼠肾损伤模型，病理表现为肾小管间质炎性细胞浸润，α-SMA表达阳性[9]，促纤维化的细胞因子TGF-β1的表达明显增强[10]，最终导致肾小管间质纤维化。

TGF-β1是目前公认的导致肾小管间质纤维化作用最强的细胞因子。本课题建立了乙醇的代谢产物乙醛导致肾小管上皮细胞损伤的体外模型。进一步研究证实，乙醛能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1。TGF-β1可能通过自分泌或旁分泌的方式，导致肾小管上皮细胞凋亡、转分化为肌成纤维细胞、促进致炎性细胞因子的释放等环节[11-13]，促进肾小管间质纤维化的发生、发展。采取措施阻断乙醛对肾小管上皮细胞内TGF-β1的合成及分泌，对减轻乙醛对肾小管上皮细胞的损伤，保护肾小管上皮细胞功能，延缓肾小管间质纤维化的进展具有一定的临床意义。

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Effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of TGF-β1in human renal tubular epithelial cells

Zhang Linxia1,Li Xiaodong2△

(1.Third Department of Geriatrics;2.Department of Nephrology,Tangshan City Workders′ Hospital, Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in human renal tubular epithelial cells,and to explore the mechanism of alcohol induced renal tubulointerstitial fibrosis.MethodsIn vitro,the human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell line) were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 5% fetal bovine serum.The cells were exposed to acetaldehyde at various concentrations (0,50,100,200 and 400 μmol/L) for 24 h.The expression of TGF-β1gene in HK-2 cells was detected by RT-PCR;and the expression of TGF-β1protein was detected by Western blot;The content of TGF-β1in the supernatant of the cells was measured by ELISA assay.ResultsRT-PCR and Western blot results showed that acetaldehyde increased the expressions of TGF-β1gene and protein in HK-2 cells in a dose-dependent manner.The results of ELISA method showed that acetaldehyde increased the content of TGF-β1in the supernatant of HK-2 cells in a dose-dependent manner.ConclusionAcetaldehyde can promote the synthesis and secretion of TGF-β1in cultured human renal tubular epithelial cells in vitro,thus promoting the progress of renal tubulointerstitial fibrosis.

acetaldehyde;renal tubular epithelial cells;transforming growth factor-β1;renal tubulointerstitial fibrosis

张林霞(1971-)，副主任医师，硕士，主要从事肾脏方面的研究。△

，E-mail:2460789769@qq.com。

论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.005

R392.11

A

1671-8348(2016)22-3038-02

2016-02-25

2016-04-11)