裸鼠肝癌移植瘤模型体内微量蛋白谱分析

于　卉，陶华林，汪碧琼

(西南医科大学第一附属医院检验科，四川泸州 646000)



裸鼠肝癌移植瘤模型体内微量蛋白谱分析

于卉，陶华林△，汪碧琼

(西南医科大学第一附属医院检验科，四川泸州 646000)

目的采用Bel-7402人肝癌细胞悬液接种裸鼠构建肝癌裸鼠移植瘤模型，探讨模型体内微量差异蛋白的表达情况。方法在裸鼠皮下接种浓度为1×107/mL的肝癌细胞悬液构建肿瘤模型，剂量为每只0.1 mL，对照组接种相同剂量无血清培养液，观察肿瘤生长情况。在不同时间点取血，用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测分析裸鼠血清中的小分子蛋白。利用Ciphergen ProteinChip 3.0 和 Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 软件进行蛋白质数据采集和分析，筛选与肝癌相关的差异蛋白。结果筛选出115个差异表达蛋白(P<0.01)，其中有5个差异蛋白表达规律性较强，质荷比(M/Z)分别为2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da。结论Bel-7402人肝癌细胞在裸鼠体内生长过程中能够表达与肝癌相关的微量蛋白质，经进一步蛋白鉴定和试剂开发可用作肝癌早期诊断的标志物。

肝肿瘤；蛋白质组学；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术；裸鼠模型

近年来肝癌发病率逐年上升，病因极其复杂，目前肝癌的诊断主要包括实验室检查、影像和超声等，但这些方法在早期诊断中均有较高的漏诊和误诊率，早期病检又有侵入性损伤，患者难以接受[1-4]。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)是近年来发展较快的一门新技术，无需样本纯化，可直接检测血液、尿液、细胞液等标本的微量蛋白，快速、高效[5-11]。本研究采用弱阳离子交换芯片(WCX2)在质谱仪上检测分析了裸鼠肝癌移植瘤模型体内的微量蛋白质谱图，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物与细胞株雌性BALB/C裸鼠32只，3周龄，体质量12～16 g，购于重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司。Bel-7402人肝癌细胞株购于上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1．2试剂Aμ蛋白芯片(Ciphergen 公司，美国)，新鲜南美胎牛血清和RPMI 1640细胞培养基(Gibco公司，美国)，0.25%胰蛋白酶(碧云天生物公司)，促肾上腺皮质激素(中科亚光公司)。

1.1.3仪器高速离心机(安亭科学仪器厂)，二氧化碳恒温孵育箱(Thermo公司，美国)，PBSⅡ/C型蛋白指纹图谱分析仪(Ciphergen 公司，美国)。

1.2方法

1.2.1Bel-7402肝癌细胞株的培养、传代肝癌细胞株经复苏后加入RMPI 1640培养基，置于37 ℃ 5% CO2的恒温培育箱内进行培养、传代，配置成浓度为1×107/mL的癌细胞悬液[12-14]。

1.2.2裸小鼠接种用乙醇消毒裸鼠的左肩背部皮肤，使用皮试注射器吸取混匀的肝癌细胞悬液0.1 mL(1×107/mL)，缓慢注射接种于裸鼠左肩背部皮下。对照组裸鼠的接种处理方法与实验组相同，但接种液为不含血清的RMPI 1640培养基。

1．2.3裸鼠血清标本的收集在移植瘤造模成功后20、40、60 d时用摘眼球法取血，标本于30 min内存放4 ℃冰箱中静置1 h，再低温3 000 r/min离心5 min，将血清分装于Eppendof管中，每份标本分装3管，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.4微量蛋白谱分析

1.2.4.1标本的处理取出待用冻存标本，用实验冰袋低温溶解后低温(4 ℃)离心(10 000 r/min 2 min)。取血清5 μL与PBS缓冲液等体积混匀，取2倍体积(即10 μL)的半饱和SPA溶液加入混合样品中混匀。

1．2.4.2活化芯片该过程应与标本的前处理同时进行，在芯片上依次加入丙酮溶液、盐酸溶液、盐酸甲醇溶液和甲醇溶液各50 μL，每加一种溶液后均需充分振荡5 min后拍干，在空气中晾干备用，所有标本加样均控制在10 min内完成。

1.2.4.3点样在活化好的金芯片上，按标记顺序依次加处理好的待测血清标本2 μL，并预留空白对照，待空气中晾干后再于每个点上加半饱和SPA溶液1 μL，待自然晾干后即可上机检测。

1.2.5数据的收集使用PBSⅡ/C 型蛋白质指纹图谱仪检测后，通过Ciphergen Proteinchip软件自动收集数据。

2　结　　果

2.1模型的构建接种Bel-7402肝癌细胞珠的裸鼠，15～20 d后出现明显肿块，对照组裸鼠则无明显异常，见图1、2。

图1　对照组裸鼠

图2　实验组裸鼠

2.2裸鼠移植瘤肿块的病理组织学检查移植瘤肿块组织经病理学检查结果显示，其肿块组织中瘤细胞异型性明显，符合肝癌的病理诊断。见图3。

图3　病理切片活检结果(×100)

2.3两组微量蛋白检测结果对照组和实验组裸鼠血清经上机检测，用相关软件对数据进行校正分析后，筛选出115个差异表达蛋白(P<0.01)，其中表达规律性较强的有5个，质荷比(M/Z)分别为2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da，尤其前4种微量蛋白表达逐渐增强，见表1、图4。

表1　裸鼠血清微量差异蛋白检测结果±s)

图4　差异蛋白表达强度与时间的关系

3　讨　　论

在本实验中通过SELDI-TOF-MS技术和Biomarker Wizard 3.1软件检测分析实验组和对照组裸鼠血清中的微量蛋白质谱，发现有115个差异表达蛋白，其中有5个微量蛋白表现出较明显的规律性变化，肝癌细胞在裸鼠体内生长过程中，其表达呈现逐渐增高或者降低的规律性，这5个微量蛋白的M/Z分别为2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da，前4个微量蛋白表达的峰值逐渐增强，后1个微量蛋白表达的峰值逐渐降低。将5个微量蛋白输入Swiss-Prot蛋白数据库进行检索发现，对应的蛋白质分别是Protein 2A，钾通道毒素、丝氨酸蛋白酶抑制剂2、神经毒素P2、亮氨酸前导反应合成肽。它们都具有不同的功能，可能在肿瘤的生长过程中发挥不同的作用。当然这种蛋白的识别具有一定的局限性，如有条件可通过专门机构进行蛋白鉴定，并进行动物免疫，制备抗体，研发与微量蛋白相对应的检测方法和试剂，有望用于临床作为肝癌早期血清标志物检测指标。

SELDI-TOF-MS技术发展迅速，尽管已成为蛋白质组学研究的理想技术平台，在各个方面的优势都较明显，如样本无需纯化、耗时短、标本需量少、速度快、大规模、高通量，但SELDI-TOF-MS技术对实验室的环境、仪器配置和实验操作条件等要求较高[6]。该技术分析微量蛋白谱时，最好同时设置内标和外标，所有标本同时检测，以减少激光衰减，芯片类型等对检测结果的影响。

原发性肝癌的病因与诱因多种多样如环境、饮食和水源、吸烟饮酒等生活习惯，细菌、病毒和寄生虫感染亦是诱发肝癌的可能因素，在不同病因或诱因的情况下可能会导致不同细胞类型的肝癌，在体内表达的微量蛋白谱也许有差异[9]，而本研究仅仅是作了一株肝癌细胞，在后续工作中还需用不同肝癌细胞株建模，研究体内蛋白表达情况，综合分析肝癌相关标志物，有利于提高肝癌早期诊断率。

本研究肝癌细胞在动物造模中采用的是皮下异位造膜，如果用肝癌细胞原位接种动物构建模型，其体内蛋白表达是否与皮下接种造模有差异，是否可用影像学的方法来观察原位接种动物模型的肿瘤生长情况及效果，还需进一步研究。

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Serum microprotein spectrum analysis in vivo of nude mice with hepatocellular carcinoma

Yu Hui,Tao Hualin△,Wang Biqiong

(Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveWe injected nude mice with human hepatoma cell line (Bel-7402),in order to analyze their serum microprotein spectrum,and so as to find the early diagnosis markers of liver cancer.MethodsWe injected every nude mice with cell suspension (concentration:1×107/mL;dosage:0.1 mL) to built the tumor model,the control group was injected with the same dose of serum free medium.We observed the growth of nude mice and sampled their blood in different time,and then we analyzed the serum microprotein spectrum by SELDI-TOF-MS and screened the proteins related to hepatoma by the embedded software (Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1).ResultsWe got 115 significantly differentiated proteins (P<0.01),and among them,there were 5 proteins expression regularity,M/Z was 2 016,3 309,3 442,3 745,2 747 Da,respectively.ConclusionBel-7402 human liver cells in nude mice in vivo growth process has five proteins have difference,further protein identification and reagent developmentcan open up a new way for early diagnosis of liver cancer.

liver neoplasms;proteomics;SELDI-TOF-MS;nude mice model

于卉(1987-)，主管技师，硕士，主要从事肿瘤蛋白组学研究。△

，E-mail:lzyxyjyx@163.com。

论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.006

R73

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1671-8348(2016)22-3040-03

2016-02-26

2016-04-02)