死亡相关蛋白激酶在急性白血病细胞中的表达及临床意义

应裴裴，杨明珍

(安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥 230032)



死亡相关蛋白激酶在急性白血病细胞中的表达及临床意义

应裴裴，杨明珍△

(安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥 230032)

目的探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)表达与急性白血病(AL)患者临床特征之间的关系。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测DAPK mRNA在54例AL患者(AL组)及18例骨髓移植供者和健康体检者(对照组)骨髓细胞或外周血中的相对表达量。结果AL组DAPK mRNA表达量(0.104 8±0.094 1)明显低于对照组(0.356 7±0.106 1)，差异有统计学意义(P<0.01)。急性淋巴细胞白血病(ALL)患者DAPK mRNA表达(0.057 7±0.099 5)低于急性髓系白血病(AML)患者(0.119 80±0.088 42)，差异有统计学意义(P=0.003 7)。DAPK mRNA表达改变与患者WBC计数、纤维蛋白原呈正相关(P<0.05)；与患者的性别、年龄、AML亚型、初诊AL第一次诱导缓解治疗疗效等结果均无相关性(P>0.05)。结论DAPK mRNA表达在白血病细胞中显著降低。

骨髓细胞；急性白血病；死亡相关蛋白激酶；逆转录-聚合酶链反应

近年研究表明，急性白血病(AL)发生是遗传和表观遗传改变及环境因素相互作用的结果，特别是启动子区甲基化，导致肿瘤抑制基因及肿瘤相关基因表达沉默，在其发生、发展中发挥了重要作用。死亡相关蛋白激酶(DAPK)是一种与肿瘤凋亡、转移等密切相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，可激活经典的p53-半胱氨酸蛋白酶(caspase)途径及不依赖于caspase凋亡途径的多条肿瘤细胞凋亡通路，同时DAPK可被Fas、γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、c-myc等因子激活，很可能是多种信号诱导肿瘤细胞凋亡的汇合点[1]。本研究采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，对AL患者细胞中DAPK mRNA的表达水平进行了检测，观察其与AL各临床指标及该病发生、发展的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2015年2～10月安徽医科大学第一附属医院血液科的54例AL患者骨髓或外周血标本。其中初治AL 38例，复发6例，慢性粒细胞白血病急变3例，骨髓增生异常综合征急变2例，第一次诱导未缓解5例。初诊AL 38例，第一次诱导缓解时，放弃治疗9例，未缓解9例，缓解18例，死亡2例(1例死于重症感染，1例死于脑出血)。所有病例均经临床、形态学、免疫学及组化染色确诊。对照组取自18例骨髓移植供者和健康体检者的骨髓或外周血单个核细胞。

1.2试剂与仪器淋巴细胞分离液，Trizol试剂(美国Invotrigen公司)，引物(上海生工生物工程有限公司)，PCR仪(德国Biometra公司)，Tanon凝胶成像系统(上海Tanon公司)，分光光度仪,低温冷冻离心机。Takara Code No.RR055A PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2购自日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1引物选择PCR引物序列参照文献[2]。DAPK上游引物：5′-GCC TGG AGA CGG AGA AGA T-3′，下游引物：5′-AAC TCC CGT GGC TGG TAG A-3′，扩增产物长度为170 bp；β-actin上游引物：AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT，下游引物：GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT，扩增片段长度为285 bp。由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化，用无RNA酶灭菌双蒸水溶解为20 μmol/L，-20 ℃保存以备用。

1.3.2细胞总RNA提取抽取对照组及AL组患者骨髓或外周血各3 mL，肝素抗凝，经淋巴细胞Ficoll分离液分离单个核细胞，取界面层单个核细胞100 μL移入1.5 mL EP管内，加入1 mL Trizol保护液中充分混匀。按TRizoL法提取RNA，所提取总RNA用DEPC处理，双蒸水溶解后用紫外分光光度计测定纯度(OD260/OD280>1.8),同时进行RNA定量。

1.3.3半定量RT-PCR总反应体系25 μL，内含prime script 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，上游、下游引物Primer(20 μm/μL)各0.5 μL。Template RNA/内参RNA 0.5 μL(<0.5 μL),RNase Free dH2O up to 25 μL。优化后最佳反应条件：50 ℃ 30 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，28个循环。对照：(1)直接用每个样本总RNA进行RT-PCR反应；(2)不加引物进行反应；(3)不加RNA进行RT-PCR反应。

1.3.4PCR产物电泳结果判定取扩增产物10 μL，在2%琼脂糖凝胶(每50 μL加5 μL GOLDview)上进行电泳，80 V，40 min。紫外线投射仪下观察并照相。根据特异性条带的有无，分别记为阳性和阴性。以目的基因DNA扩增带密度与β-actin扩增片段密度比值为其mRNA表达水平的定量指标。

2　结　　果

2.1DAPK mRNA的表达DAPK mRNA在部分AL患者骨髓单个核细胞中的表达电泳图见图1。AL组DAPK mRNA表达水平明显低于对照组(0.104 8±0.094 1 vs.0.356 7±0.106 1，P<0.01)。

1：对照组；2、3、4、6、7、8、9、10：AL组；5：空白对照组；11：DNA mark 500。

图1DAPK mRNA的表达电泳图

表1　初诊AL患者骨髓单个核细胞中DAPK mRNA表达与临床特征WBC相关性±s)

2.2DAPK mRNA表达与AL临床表现的关系初诊AL患者中，WBC≥20×109/L组DAPK mRNA表达高于WBC<20×109/L组(P=0.016)；初诊急性髓系白血病(AML)患者，WBC≥20×109/L组DAPK mRNA表达高于WBC<20×109/L组(P<0.01)；初诊急性淋巴细胞白血病(ALL)患者，WBC≥20×109/L组与WBC<20×109/L组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。AML患者DAPK mRNA表达高于ALL患者(P=0.037)，纤维蛋白原(Fib)大于或等于4 g/L组高于小于4 g/L组(P=0.031)，初诊AL患者中WBC≥100×109/L组高于WBC<100×109L组(P=0.019)；与患者的性别、年龄、初诊诱导治疗疗效均无相关性(P>0.05)，见表2。对初诊AML 25例患者进行白血病分型，其中M1 3例，M2 13例，M4 1例，M5 8例，DAPK mRNA表达与AML亚型无相关性(P>0.05)，因M1、M4例数过少未进行比较分析，见表3。

表2　AL患者骨髓单个核细胞中DAPK mRNA表达与临床特征的相关性±s)

表3　初诊AML患者DAPK mRNA表达与其亚型的相关性

3　讨　　论

凋亡受阻是人类肿瘤的重要特征之一，白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发生、发展与白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻密切相关。DAPK是一种重要的凋亡前基因，定位于人类染色体9q34．1，全长4 293 bp，是一种钙离子调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过去磷酸化激活来调控细胞凋亡；其家族至少有5个成员，在各种组织中广泛表达，参与外源性和内源性凋亡通路，启动诱导凋亡途径，是凋亡的正性调节因子之一[3]。DAPK的结构包括一个核心的激酶区、钙离子/钙调蛋白结合区、锚蛋白重复序列区、P-环、细胞骨架结合区、死亡区和富含丝氨酸的尾部7个部分。核心激酶区位于钙离子/钙调蛋白结合区与N-端之间,由11个丝/苏氨酸结构组成,还含有一个保守的赖氨酸残基,该残基与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的结合有关,若发生突变(K42W或K42A)会引起凋亡作用的消失[4-6]。

研究结果表明，DAPK基因在正常组织中均有表达，而在一些人类肿瘤细胞株和原发性恶性肿瘤如B细胞、T细胞来源的恶性肿瘤、鼻咽癌、卵巢癌/子宫癌、鳞状细胞癌、肺癌、结直肠癌等组织中DAPK的表达异常低下或缺失[6-13]，而且其表达缺失也与其CpG岛的甲基化改变密切相关，提示与癌症的发生、发展有着密切的联系。本研究显示，DAPK基因在白血病细胞中的表达明显低于健康人单个核细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，与上述结论一致，进一步证实DAPK基因是潜在的白血病抑制基因。

通过分析DAPK表达与AL临床特征之间的关系发现，ALL组DAPK mRNA表达量低于AML组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示DAPK表达缺失在ALL中可能较AML有更高潜在促进白血病细胞发生、发展的风险，其具体作用机制尚有待进一步研究。相关分析显示，DAPK表达与初诊AL WBC计数呈正相关，但均明显低于对照组。AL的发生与白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻密切相关，可能在WBC≥20×109/L患者发病过程中白血病细胞增殖失控起主要作用。进一步研究发现，初诊ALL中DAPK表达与WBC计数无相关性，而初诊AML中DAPK表达与WBC计数依然呈正相关性，有研究报道DAPK主要表达在较成熟细胞[14]，可能髓系WBC≥20×109/L患者较髓系WBC<20×109/L患者白血病细胞发育成熟些，细胞越原始，DAPK相对表达越低。DAPK导致AML发生是否存在其他机制，尚需大量研究证实。因时间原因仅对初诊AL患者第一次诱导治疗疗效进行分析，未进行长期动态随访，生存率与DAPK mRNA表达是否相关，尚需大量研究证实。肿瘤的转移过程与黏附紧密相关。血浆Fib 是一种糖蛋白,由肝细胞合成和分泌,其主要生理功能是作为凝血因子Ⅰ直接参与体内凝血过程，同时其与细胞黏附、伸展移动、增殖和分化密切相关。有研究显示[15]，Fib及其降解产物在患癌时增高,可增强血小板对癌细胞的黏附,从而利于癌细胞的转移,故Fib 水平升高往往预示着肿瘤有转移的倾向。本研究发现，DAPK mRNA表达改变与患者Fib呈正相关，在白血病患者中高水平表达DAPK mRNA可能预示有高度侵袭和转移倾向。血液的高凝状态与恶性肿瘤的发生、发展及复发转移有着密切的关系，恶性肿瘤患者的血液多存在明显的高凝状态[16]。提示在白血病患者中DAPK mRNA表达较高者血液多存在明显的高凝状态。本研究发现AL细胞中DAPK mRNA表达量明显低于对照组，表明DAPK表达缺失可能是AL发生、发展重要机制之一，而在高水平表达DAPK mRNA AL患者中，Fib明显增高，可能在该类患者发病机制中Fib高表达占有重要作用。本研究因患者就诊时间干扰，实验样本量不足，受时间实验条件等客观因素限制，未能进行大样本实验，其结果有待于进一步验证。

肿瘤细胞中的一些抑癌基因高度甲基化可导致基因转录失活[17]，牛一蒙等[18]通过RT-PCR检测到AL患者中DAPK启动子区甲基化与其mRNA的异常表达有关，目前广泛认为DAPK在肿瘤组织中降低是由于其启动子区CpG岛区发生异常甲基化。本研究结果也证实了DAPK在AL细胞尤其ALL中异常低表达。研究DAPK分子作用机制及其参与肿瘤发生、发展的信号传导过程，探求阻断其信号传导或抑制其作用的方法，可能为未来肿瘤的治疗提供新的视野。

[1] Cohen O，lnbal B，Kissil JL，et al．DAP-kinase participates inTNF-alpha-and Fas-induced apoptosis and its function requires the death domain[J]．J Cell Biol，1999，146(2)：141-148．

[2]Raval A，Tanner SM，Byrd VC,et al.Dounregulation of death associated protein kinase 1(DAPK1) in chronic 1ymphocytic leukemoa[J]．Cells，2007,129(5)：879-890．

[3] Kogel D，Prehn JH，Scheidtmann KH.The DAP kinase family of pro-apoptotic；novel players in the apototic game[J].Bioessays，2001，23(4)：352-358．

[4]Zhao XL,Meng ZY,Qiao YH,et al.Promoter methylation of DAPK gene in cervical carcinoma[J].Ai Zheng,2008,27(10):919-923.

[5]Yanagawa N,Osakabe M,Hayashi M,et al.Detection of HPV-DNA,p53 alterations,and methylation in penile squamous cell carcinoma in Japanese men[J].Pathol Int,2008,58(5):477-482.

[6]Kissil JL，Feinstein E，Cohen O，et al．DAP-kinase loss of expression in various carcinoma and B-cell lymphoma cell Lines：possible implications for role as tumor suppressor gene[J]．Oncogene，1997，15(5)：403-407．

[7] Aggerholm A，Hokland P.DAP-kinase CpG island methylation in acute myeloid leukemia：methodology versus biology? [J]．Blood，2000，95(30)：2997-2999．

[8] Nakatsuka S，Takakuwa T，Tomita Y，et al．Hypermethylation of death-associated protein(DAP)kinase CpG island is frequent not only in B-cell hut also in T-and natural killer(NK)/T-cell malignancies[J]．Cancer Sci，2003，94(1)：87-91．

[9] Wong TS，Chang HW，Tang KC，et al．High frequency of promoter hypermethylation of the death-associated protein-kinase gene in nasopharyngeal carcinoma and its detection in the peripheral blood of patients[J]．Clin Cancer Res，2002，8(5)：433-437.

[10] Bai T，Tanaka T，Yukawa K，et al．Reduced expression of death-associated protein kinase in human uterine and ovarian carcinoma cells[J]．Oncol Rep，2004，11(7)：661-665．

[11] Ogi K，Toyota M，Ohe-Toyota M，et al．Aberrant methylation of multipie genes and clinicopathological features in oral squamous cell carcinoma[J]．Clin Cancer Res，2002，8(32)：3164-3171．

[12]Toyooka S，Toyooka KO，Miyajima K，et al．Epigenetic down-regulation of death-associated protein kinase in lung cancers[J]．Clin Cancer Res，2003，9(30)：3034-3041.

[13]SatohA，ToyotaM，ItohF，etal．DNAmethylationandhistonedeacetylationassociatedwithmilencingDAP-kinasegeneexpressionincolorectalandgastriccancers[J]．BrJCancer,2002,86(20)：1817-1823．

[14] 吴红红,曹晖,王亚哲,等.CD7阳性急性髓系白血病骨髓干/祖细胞5个基因表达的研究[J].中国实验血液学杂志,2009,17(2):298-303.

[15]朱明霞,彭佳,倪飞,等.恶性淋巴瘤患者血浆纤维蛋白原水平与功能测定的临床意义研究[J].血栓与止血学,2010,16(5):210-212.

[16] Voland C，Serre CM，Delmas P.Platelet-osteosarcoma cell interaction is mediated through a specific fibrinogen-binding sequence located within the N-terminal domain of thrombospondin[J].J Bone Miner Res，2000，15(4)：361-368.

[17]Giuseppe L,Luciana T,Maria Teresa V,et al.DNA methylation and demethylating drugs in myelodysplastic syndromes and secondary leukemias[J].Haematologica,2002,87(12):1324-1341.

[18] 牛一蒙,王萍萍,王玥,等.急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究[J].中国实验血液学杂志,2014,22(1):111-112.

The expression and clinical significance of death-associated protein kinase in acute leukemia

Ying Peipei,Yang Mingzhen△

(Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230032,China)

ObjectiveTo detect expression of death-associated protein kinase (DAPK) in acute leukemia cells,explore the relationship between DAPK expression and clinical characteristics of patients with acute leukemia(AL).MethodsThe relative expression of DAPK mRNA in leukemic cells and normal bone marrow cells or peripheral blood was detected by semi quantitative RT-PCR method.ResultsThe expression of DAPK mRNA in bone marrow or peripheral blood samples of 18 normal control group was 0.356 7±0.106 1,The expression of DAPK mRNA in bone marrow or peripheral blood samples of 54 patients with acute leukemia was 0.104 8±0.094 1,the experimental group was significantly lower than the control group,the difference was statistically significant (P<0.01).In the experimental group,the relative expression of 13 ALL patients was 0.057 7±0.099 5,and the relative expression of in 41 patients with AML was 0.119 80±0.088 42,AML group was lower than that of ALL group(P=0.003 7).DAPK mRNA expression was positively correlated with the white blood cell count and fibrinogen content of the patients(P<0.05);and had no correlation with sex,age,fusion gene,platelet count,LDH value,acute myeloid leukemia subtype,and first remission induction therapy in newly diagnosed acute leukemia patients(P>0.05).ConclusionDAPK mRNA expression was significantly decreased in leukemia cells.

bone marrow cells;acute leukemia;death-associated protein kinase;reverse transcriptase PCR

应裴裴(1991-),硕士，主要从事血液内科工作。△

，E-mail:Yangmingzhenymz@163.com。

论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.017

R733.71

A

1671-8348(2016)22-3072-03

2016-03-27

2016-05-15)