冷鲜调理肉三种乳酸菌发酵剂的筛选

张　飞，刘　哲，罗爱平*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

冷鲜调理肉三种乳酸菌发酵剂的筛选

张飞，刘哲，罗爱平*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

为筛选出符合冷鲜调理肉制品发酵的优质乳酸菌发酵剂，对3株乳酸菌的发酵特性进行研究，通过耐盐、耐亚硝酸盐、产粘、产酸能力、蛋白质和脂肪分解能力、菌种间的拮抗作用等试验对其进行优势菌种筛选。结果表明，菌株LLSL、LP、LGG对食盐和亚硝酸盐具有较好的耐受性，能在6%的食盐溶液和150 mg/L亚硝酸盐溶液中存活，能有效产酸，无降解蛋白质和脂肪能力，不产气、不产氨、不产H2S；其中，菌株LLSL、LP不产粘，两者间无拮抗作用，可作为于冷鲜调理肉制品的发酵剂；菌株LGG产粘，影响冷鲜调理肉制品的感官品质和内部组织状态，不适合作为冷鲜调理肉制品的发酵剂。

乳酸乳球菌乳酸亚种；植物乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；筛选；发酵剂

冷鲜调理肉制品因食用方便，又能较好地保持肉的营养与风味，包装精美和小容量化，以及免除清洗、切割、调理等步骤而广受消费者青睐。其产品附加值较高、受国际产品竞争冲击较小的优点而被生产者推崇。但是货架期短成为生鲜调理肉制品发展的主要制约因素。将调理肉制品与发酵肉制品有机结合，不仅延长货架期，还可以改善肉制品风味。

发酵肉制品中的微生物包括乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母等，在整个发酵过程中，乳酸菌起着至关重要的作用［1］。发酵过程中乳酸菌的添加不仅可以有效降低产品的pH值、改善肉制品的组织结构和风味，而且可以降低产品中的亚硝酸盐残留、减少亚硝胺形成、抑制腐败菌的生长和毒素的产生［2］。但并不是所有的乳酸菌都适合作为肉品发酵剂，乳酸菌的发酵性能差异对产品质量将产生很大的影响。如产生H2S、产粘将影响肉品的感官品质。

根据发酵肉制品发酵剂的基本要求，乳酸菌发酵剂应具有以下几个特征：（1）能在6%的食盐中正常生长，在80～100 mg/L质量浓度亚硝酸盐中生长良好；对食盐和亚硝酸盐有一定的耐受力；（2）对蛋白质、脂肪无明显直接分解作用；（3）无致病性，为益生菌；（4）产生乳酸，属同型发酵，不产粘；（5）菌种间无拮抗作用［3-4］。

本研究选用乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.Lactis，LLSL）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）三株益生菌为发酵菌株。菌株LLSL不仅能产生乳酸，而且代谢产生的乳酸链球菌素（Nisin）［5］可延长肉制品的保质期［6］，但在发酵肉制品中的应用鲜见报道；菌株LP在发酵肉制品中被广泛应用［7］并与其他乳酸菌有协同作用［8］；菌株LGG仅产L-乳酸并促使发酵骨粉提高骨粉中钙转化率的［9］。以肉制品发酵剂应具有的特性为依据进行研究，筛选适宜冷鲜调理肉乳酸菌的发酵菌株，为实现发酵调理肉制品的安全化和工业化生产提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.Lactis，LLSL）1.2281：购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）1.0557：贵州大学生命科学学院微生物实验室提供；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）1.2466：中国科学院微生物研究所。

1.1.2培养基

MRS肉汤培养基：蒸馏水100 0 mL，乳酸菌专用MRS肉汤培养基，按说明配制，121℃高压灭菌15 min，备用。用于菌种活化。

MRS固体培养基：蒸馏水1 000 mL，牛肉浸膏10.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，KH4PO32.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，MgSO40.58 g，M琼脂粉15 g。121℃高压灭菌15 min，备用。用于菌种产粘性试验。

葡萄糖产气培养基：蒸馏水100 0 mL，牛肉浸膏10.0 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖1.0 g，氯化钠10.5 g，调pH至7.4，加入溴甲酚紫溶液，待呈现紫色后再加葡萄糖。溶解分装于试管，最后将杜氏小管倒置试管中，121℃高压灭菌15 min。

产H2S培养基：蒸馏水1 000 mL，蛋白胨10.0 g牛肉浸膏7.5 g，明胶5.0 g，氯化钠5.0 g，10%FeCl3l25 mL，调pH值7.0，115℃高压灭菌15 min。

产氨培养基：脱脂牛奶100 mL，精氨酸0.5 g，氯化钠0.5 g，115℃高压灭菌15 min。

1.1.3试剂

蛋白胨、酪蛋白胨、酵母膏、牛肉膏（均为生化试剂）：北京陆桥技术有限责任公司；酒精、碘化汞、碘化钾、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、亚硝酸钠、氯化钠、氢氧化钠等（均为分析纯）：重庆茂业化学试剂有限公司；中性红、溴甲酚指示剂：沈阳市试剂三厂。

1.2仪器与设备

JM2003电子天平：余姚纪铭称重校验设备有限责任公司；SHP-250型智能生化培养箱：上海光都仪器设备有限公司；WFJ7200型可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DHG-R40A型热风恒温鼓风干燥箱：上海试验仪器总厂；100型笔式pH计：上海三信仪表厂；CJ-1D超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1菌种活化

将菌种分别接入MRS液体培养基，菌株LLSL、LGG在37℃条件下培养，菌株LP在34℃培养，活化扩大培养，备用。用于发酵肉制品的发酵剂，菌种的活菌数均不得＜106CFU/g［10］，菌株LLSL传代活化4次，菌株LGG、 LP传代活化3次，培养24 h后其活菌数为108CFU/mL，＞106CFU/mL，表明3株益生菌均已复壮活化，达到发酵肉制品的要求。

1.3.2耐盐、耐亚硝酸盐试验

在MRS液体培养基中分别添加质量分数为0、2%、4%、6%、8%的食盐和质量浓度为0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的亚硝酸盐，分别接种试验菌株，菌株LLSL、LGG 37℃培养，菌株LP 34℃培养，48 h后，用分光光度计在波长600 nm处测定吸光度值（OD600nm），以空白MRS液体培养基作为对照。

1.3.3产酸能力的测定

在MRS肉汤培养基中分别接种等量的乳酸菌，菌株LLSL、LGG在37℃条件下培养，菌株LP在34℃培养，每隔12 h测定肉汤培养基pH值，并测定48 h内pH值变化情况。

1.3.4产粘试验

在MRS固体平板培养基上接种3株乳酸菌，菌株LLSL、LGG37℃培养（菌株LP34℃培养）48h，挑取菌落直接观察。

1.3.5蛋白质降解活性试验

将3株乳酸菌分别涂布于含有15%脱脂乳的MRS固体培养基中，恒温37℃培养48 h。观察菌落周围是否有透明圈，出现透明圈则为阳性。

1.3.6脂肪分解活性试验

将3株乳酸菌分别涂布于含有15%猪油脂和中性红指示剂的MRS固体培养基中，菌株LLSL、LGG 37℃培养（菌株LP 34℃培养）48 h。观察培养基的颜色变化，培养基出现红色斑点为阳性。

1.3.7产气试验

在葡萄糖产气培养基中接种待测乳酸菌，菌株LLSL、LGG 37℃培养（菌株LP 34℃培养）24 h。观察杜氏小管内是否有气泡生成。

1.3.8产氨试验

在产氨培养基中接种待测乳酸菌，另取未接种的培养基做空白对照试验，菌株LLSL、LGG 37℃培养（菌株LP 34℃培养）24 h，加3～5滴氨试剂在培养液中，若有黄色或棕红色的沉淀为阳性，否则为阴性。

1.3.9产H2S试验

乳酸菌穿刺接种于产H2S培养基中，菌株LLSL、LGG 37℃培养（菌株LP 34℃培养）24 h。出现黑色沉淀线为阳性，反之为阴性。

1.3.10菌种间的拮抗试验

将乳酸菌混合接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养，革兰氏染色镜检，观察菌株的生长情况。

1.3.11数据分析

采用Excel和DPS软件进行分析，OriginPro9.0软件制图。

2　结果与分析

2.1菌株耐盐能力的测定

肉制品加入食盐不但具有调味作用，而且还有防腐、提高保水性等作用，不同食盐添加量影响肉制品发酵过程中微生物的生长繁殖及最终产品的品质［11］。一般肉制品加工的食盐质量分数在2%～2.5%，腌腊制品食盐质量分数则在5%以上，发酵肉制品中的乳酸菌在一定范围内要有良好的耐盐性，耐盐能力达到6%［12］。三株乳酸菌在不同食盐质量分数条件下的OD600nm值见图1。

图1　不同食盐质量分数对三株菌株生长的影响Fig.1 Effect of different salt concentrations on growth of three lactic acid bacteria

由图1可知，食盐对三种乳酸菌均有不同程度的影响。随着食盐含量升高，三株乳酸菌的OD600nm值均逐渐降低，当食盐含量升高至8%时，三株乳酸仍能生长，菌株LLSL、LGG和LP的OD600nm值分别为0.680、0.621和0.512，分别下降了44.12%、48.16%和52.92%。结果表明，菌株LLSL的耐盐性最强，其次是菌株LGG和LP，三株乳酸菌均有较好的耐盐性，符合发酵肉制品发酵菌株的要求。

2.2耐亚硝酸盐能力的测定

肉制品加入亚硝酸盐，可抑制致病菌的生长，改善肉制品的色泽和风味。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定肉制品中亚硝酸盐的最大使用量为0.15 g/kg，最大残留量为50 mg/kg。亚硝酸盐的加入抑制发酵微生物的生长繁殖，影响正常发酵。三株乳酸菌在不同亚硝酸盐质量浓度条件下的OD600nm值见图2。

图2　不同亚硝酸盐质量浓度对三株菌株生长的影响Fig.2 Effects of different nitrite concentrations on growth of three lactic acid bacteria

由图2可知，三株乳酸菌的OD600nm值随着亚硝酸盐的增加而减小，说明亚硝酸盐对三株乳酸菌的生长均有不同程度的抑制作用。当添加的亚硝酸盐质量浓度为150 mg/L时，菌株LLSL的OD600nm值由1.198下降至0.531，下降55.68%；菌株LGG的OD600nm值由1.217下降至0.877，下降27.94%；LP的OD600nm值由1.065下降至0.632，下降40.66%；结果表明，三株乳酸菌耐亚硝酸盐能力为LGG＞LP＞LLSL，三株乳酸菌均能在亚硝酸盐质量浓度为150 mg/L的培养基中存活，符合肉制品发酵菌株的要求。

2.3产酸能力的测定

产酸能力是筛选发酵菌种的一个重要指标。发酵菌种产酸速率越大，pH值下降越快，较低pH将抑制腐败菌和病原菌的生长。三株乳酸菌的产酸能力见图3。

图3　三株乳酸菌48 h的产酸能力Fig.3 The acid production of three lactic acid bacteria in 48 h

由图3可知，随着培养时间的延长，培养基pH值先迅速下降后趋于平缓，当培养12 h时，菌株LLSL、LP、LGG培养基pH值分别下降为5.01、4.84、4.32，菌株LGG培养基pH值下降速率最快；当培养时间为48 h时，菌株LLSL、LP和LGG培养基pH值分别为4.25、3.65和3.86。结果表明，三株乳酸菌均能有效产酸，且产酸速率为菌株LGG＞LP＞LLSL，菌株LP产酸能力较强，适用于发酵肉制品。

2.4三株乳酸菌的发酵特性

表1　三株乳酸菌的发酵特性Table 1 The fermentation characteristics of three lactic acid bacteria

乳酸菌代谢产物产生粘液物质，将破坏肉内部组织状态，影响其感官［13］；若加入的发酵剂具有脂肪降解的能力，则会造成成品在贮藏销售过程中脂肪降解易产生酸败味；若加入的发酵剂具有较强的蛋白质降解作用，在产品的贮藏销售过程易造成腐败现象，降低了产品的货架期和微生物安全性［14］；异型发酵的乳酸菌作为肉制品发酵剂，将产生大量CO2气体，影响肉结构的致密性；乳酸菌在发酵过程中产生NH3等不良气体，影响肉制品的风味；产生H2S，影响产品的风味和色泽；三株乳酸菌的发酵特性见表1。

由表1可知，菌株LP、LLSL、LGG降解蛋白质、脂肪及产气、产氨、产H2S特性均呈阴性，菌株LLSL、LP产粘为阴性，菌株LGG为阳性；表明三菌株均无降解蛋白质、脂肪的能力；均未产气、产H2S、产氨，菌株LLSL与LP不产粘，菌株LGG产粘。结果表明，菌株LP、LLSL符合发酵肉制品乳酸菌发酵剂各项基本要求，是理想的肉用乳酸菌种。据SUSANNAE等［15］报道，菌株LGG较适合发酵干香肠。但本研究将菌株LGG接种于冷鲜调理肉制品进行发酵，探索该菌株是否适宜冷鲜调理肉的发酵菌株，结果表明，肉的表面产生大量粘液，影响冷鲜调理肉制品的感官和内部组织状态，故菌株LGG不适宜用于冷鲜调理肉制品的发酵菌株。

2.5菌种的拮抗性研究

从对产品的风味和状态的影响上来看，两种或两种以上菌种混合发酵，比使用单一发酵剂有更好的效果。这就要求混合发酵的菌种间要有较好的共生作用，而不能有显著的拮抗性。根据上述试验的初步结果，研究针对菌株LP和LLSL的拮抗性进行试验，结果见表2。

表2　菌株LP与LLSL拮抗作用试验结果Table 2 Test results of antagonism between strains LP and LLSL CFU/mL

由表2可知，培养12 h后，混合菌液的菌落总数为单一培养菌株LP的15倍、菌株LLSL的13.2倍；18 h后，混合菌液的菌落总数为菌株LP的3.48倍，为菌株LLSL的2.23倍；24 h后，混合菌液的菌落总数为菌株LP的2.25倍，为菌株LLSL的3.09倍。结果表明，菌株LP与LLSL在同一环境中生长繁殖良好，无显著的拮抗作用，菌株LP与LLSL可作为冷鲜调理肉的混合发酵剂。

3　结论

本研究通过对三株乳酸菌进行生长能力、耐盐性、耐亚硝酸盐、产酸能力、发酵特性等进行研究。结果表明，三株乳酸菌均有较好的耐盐性，在食盐含量为8%的条件下仍能生长，对质量分数为150 mg/L的亚硝酸盐具有一定的耐受作用，能有效产酸，无降解蛋白质、脂肪能力，不产气、不产H2S、不产NH3，符合发酵肉制品乳酸菌发酵剂的要求。菌株LLSL与LP不产粘，且通过菌种间拮抗作用研究表明，菌株LLSL与LP两菌株之间无明显拮抗作用，可作为冷鲜调理肉的复合发酵剂，其在冷鲜调理肉中的应用有待进一步研究；而菌株LGG产粘，不适宜用于冷鲜调理肉制品的发酵菌株。

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Screening of three lactic acid bacteria starter cultures in fermented chilled and prepared meat

ZHANG Fei，LIU Zhe，LUO Aiping*
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to screen high-quality lactic acid bacteria starter cultures adapted to fermented chilled and prepared meat products，the fermentation characteristics of three lactic acid bacteria were researched and screened by the experiments of salt tolerance，nitrite tolerance，viscosity producing，acid-producing ability，the ability to protein and fat decomposition and the antagonism between strains.The results showed that strain LLSL，LP and LGG all had good tolerance on salt and nitrite，could survive in 6%salt and 150 mg/L nitrite solution，had ability of acid production effectively.They did not decompose protein and fat and produce gas，ammonia and H2S.Strain LLSL and LP which did not produce mucilage and had no antagonism were used as starter culture of chilled and prepared meat products.Strain LGG could produce mucilage to influence the sensory quality and internal texture，which was not suitable for starter culture of chilled and prepared meat products.

Lactococcus lactissubsp.Lactis；Lactobacillus plantarum；Lactobacillus rhamnosus；screen；starter cultures

TS255

0254-5071（2016）03-0104-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.023

2015-12-08

贵州省科技厅攻关课题（黔科合NZ字［2012］3010号）

张飞（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品营养与质量安全。

罗爱平（1958-），女，教授，本科，主要从事畜产品加工与开发工作。