海洋胶红酵母菌CD-008产超氧化物歧化酶发酵条件优化及酶分离纯化

金连豆，李晓艳*，王晓辉，迟乃玉，张庆芳，张旭姣，王　强

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622）

海洋胶红酵母菌CD-008产超氧化物歧化酶发酵条件优化及酶分离纯化

金连豆1，2，李晓艳1，2*，王晓辉1，2，迟乃玉1，2，张庆芳1，2，张旭姣1，2，王强1，2

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622）

在单因素试验基础上，结合Plackett-Burman、Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析以确定海洋胶红酵母菌Rhodotorulasp.CD-008产超氧化物歧化酶最佳发酵条件，并通过盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析研究了酶的分离纯化条件。结果表明，pH、转速、温度对酶活力有显著影响，最优发酵条件为pH 5.34、转速150 r/min、温度21.40℃，优化后发酵液酶活力达到6 430.52 U/g湿菌体，比优化前提高了1.53倍。粗酶液经65%饱和度的硫酸铵盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析后获得的SOD比酶活达到419.90 U/mg，纯化倍数为9.60倍，蛋白回收率为8.2%。SDS-PAGE凝胶电泳显示，纯化后的SOD的分子质量约为37.5 ku。

海洋胶红酵母菌CD-008；超氧化物歧化酶；发酵条件；分离纯化

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一类广泛存在于生物体内的酸性金属酶，能够专一地去除破坏体内新陈代谢的超氧阴离子，被称为“人体垃圾的清道夫”［1］。超氧化物歧化酶不仅在体内氧化与抗氧化平衡过程中起到重要作用，在肿瘤的检测研究中也得到应用，如SOD mRNA的表达含量可以作为判定乳腺浸润性导管癌治愈的指标［2］；在疾病的治疗、辐射的防护过程中，SOD还可以清除体内多余的超氧阴离子自由基（O2－·），进而保护NO活性，调节血管中血压，从而保持血管血流畅通［3］，以及在提高植物抗逆性等方面研究已经达到较高的水平，姚冉等［4］已成功克隆得到可以提高烟草对盐胁迫耐受性的SOD基因。目前，SOD作为抗氧化剂也成功地进军到医药、食品、化妆品等各大行业中，成为学者们争相研究的热门酶类之一［5］。

自1997年从牛血中提取到SOD，引起交叉感染后，欧盟法令规定，禁止从动物中提取SOD，因此，SOD的大部分来源便转移到植物，但植物提取SOD工艺极为复杂，而微生物发酵法的兴起则大大拓展了SOD来源，既方便又快捷。迄今为止，人们已经成功从细菌、霉菌、放线菌、酵母菌等微生物体内分离得到了SOD，根据所含金属辅基的不同，SOD可分为主要存在于真核细胞质中的Cu/Zn-SOD；原核及真核细胞基质中的Mn-SOD；原核细胞、真核藻类和高等植物中的Fe-SOD以及近来从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）及天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）中的Ni-SOD［6］、朱秀敏等［7-8］在牛肝中发现了Co-SOD和一种存在于细胞外体液的SOD（EC-SOD）。张博润等［9］经培养条件优化后，成功选育出SOD产量可达2 075 U/g湿菌体的酵母菌ZDF48，迟乃玉等［10］也运用理化条件复合诱变，选育出SOD产量达到9100U/g湿菌体的乳酸菌Sn-898，邢德明等［11］通过优化培养基条件，培育出SOD含量高达4 206 U/g的乳酸菌SD06S，郑洲等［12］也分离出四株产SOD南极嗜冷菌（Marinomonassp.）NJ062、NJ379、NJ522和NJ548。

微生物生产工业上应用的SOD菌株产酶量不高，可以通过优化菌株产酶条件来提高产酶量。所以，研究菌株产酶条件就显得极为重要。本研究采用Plackett-Burman（P-B）法设计试验，结合Box-Behnken（B-B）设计和响应面法（response surface methodology，RSM）以及运用软件Design-Expert对海洋胶红酵母菌（Rhodotorulasp.）CD-008产超氧化物歧化酶的发酵条件进行优化，以提高产酶量，并通过盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析对SOD酶进行分离纯化，为以后工业生产酶制剂奠定了科学基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

海洋胶红酵母菌（Rhodotorulasp.）CD-008分离自渤海海泥（123°371′E，39°6972′N）于辽宁省海洋微生物工程技术研究中心保藏。

1.1.2培养基

固体活化培养基：麦芽糖2.0%，酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，琼脂2.0%，陈海水配制，pH自然。

液体发酵培养基：麦芽糖2.0%，酵母膏0.5%，CuSO40.08 mmol/L，由陈海水配制，pH自然。

1.1.3试剂

邻苯三酚：上海展云化工有限公司；硫酸铵：天津市科密欧化学试剂有限公司；葡聚糖凝胶G-100：沈阳市联邦试剂厂；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海双龙化学品厂；丙烯酰胺：云超化工有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

HZP-250全温振荡培养箱：上海精宏实验设备有限公司；5417 R低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技有限公司；UV-2102C紫外可见分光光度计：龙尼柯仪器有限公司；DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3方法

1.3.1菌种活化

在无菌条件下，将海洋胶红酵母保藏菌种转接到固体活化培养基中，22℃恒温培养1～2 d，活化2次。

1.3.2粗酶液的制备

将活化好的菌株接种到液体发酵培养基中，于22℃、150r/min发酵30h。发酵菌液于4℃、4000r/min离心30min，得到湿菌体，用超纯水将菌体水洗2次，4℃、4 000 r/min离心30 min。将离心得到的湿菌体用磷酸缓冲液（pH7.8）溶解。于480 W超声波冰浴下破碎30 min（破碎5 s，间隔5 s）。破碎后，4℃、10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，留上清，即为粗酶液。

1.3.3SOD酶活力检测

SOD酶活力的检测采用邻苯三酚自氧化法［13-14］。以1mL反应液于25℃，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速度50%的用酶量定义为一个SOD酶活力单位（U/g湿菌体）。

1.3.4单因素试验

为确定各种环境因素对酶活力的影响，分别以转速（100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min）、装液量（70mL/250mL、80mL/250mL、90mL/250mL、100mL/ 250 mL、110 mL/250 mL）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、温度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）作为唯一变量，进行单因素筛选试验，将最高酶活力设定为100%，其余用相对值表示。考察其对SOD相对酶活的影响。

1.3.5发酵条件优化

（1）Plackett-Burman试验设计

在前期单因素试验的基础上，选择5个因素进行12次试验（N=12），用Design-Expert软件进行试验设计，根据结果对其进行显著性分析。试验中每个因素根据单因素试验结果设定2个水平，Plackett-Burman试验设计因素与水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

（2）最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验得出的显著因素效应大小设定其步长，进行最陡爬坡试验，找出酶活最高响应值的区域。

（3）Box-Behnken设计及响应面分析

根据Plackett-Burman试验确定影响酶活的主要3个因素，最陡爬坡试验获得因素响应区域的中心点，采用Design-Expert软件进行Box-Behnken设计，3因素3水平响应面的分析试验因素与水平见表2。

表2　Box-Behnken试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6SOD酶分离纯化

将海洋胶红酵母CD-008SOD粗酶液经饱和度65%的硫酸铵4℃盐析12 h后，用0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.8）溶解沉淀蛋白，测定酶活，计算蛋白回收率；溶解后蛋白经过预处理的（截留分子质量10 ku）超滤管超滤，4℃，4000r/min离心30min，移液枪小心取出浓缩液，溶于（pH7.8）0.05 mol/L的磷酸缓冲液，测定酶活，计算蛋白回收率；取2 mL超滤后SOD酶液加入预先用pH 7.8 0.05 mol/L的磷酸缓冲液平衡过的Sephadex G-100凝胶过滤层析柱（1.6 cm× 100 cm），调节洗脱速度及蛋白自动收集器，每管收集2 mL，收集含SOD酶各管，测定其酶活力，合并含酶活力各管。

1.3.7检测方法

（1）蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法［15］，绘制蛋白标准曲线方程为y= 0.009 2x+0.020 4（R2=0.994 6），结合蛋白标准曲线方程测定蛋白质含量。

（2）SOD分子质量的测定

按照LAEMMLI U K等［16］的方法采用质量分数为8%的分离胶和5%的浓缩胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），电泳结束凝胶用考马斯亮蓝染色30 min后脱色，确定收集酶活洗脱液中蛋白条带，以预染蛋白MarkerThermo26616为对照，考察并计算SOD的分子质量。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

考察转速、装液量、接种量、温度和pH值对SOD相对酶活的影响，结果如图1所示。

图1　转速（a）、装液量（b）、接种量（c）、温度（d）、pH（e）对SOD相对酶活的影响Fig.1 Effects of rotate speed（a），liquid volume（b），inoculum（c），temperature（d），pH（e）on SOD relative enzyme activity

由图1可知，SOD相对酶活随着转速、装液量、接种量、温度和pH值的增加均呈先升高后降低的趋势。SOD相对酶活分别在转速140 r/min、装液量90 mL/250 mL、接种量3%、温度22℃、pH 5.5时到达最大值，因此以此最适发酵条件进行下一步研究。

2.2发酵条件优化试验设计和分析

2.2.1Plackett-Burman试验设计

根据单因素试验选取对菌株SOD相对酶活力具有显著影响的5个因素，以菌株Rhodotorulasp.CD-008粗酶液的SOD酶活力（Y）作为响应值，选取N=12，进行P-B设计，分别计算各因素的效应，并对其进行显著性评价，结果见表3。

由表3的分析结果可知，A、B、C、D、E各因素的效应值分别为-414.3、263.8、-448.4、-370.1、521.0，由P值的大小可知，各因素对SOD酶活力影响重要性排序为E＞C=A＞D＞B，即pH＞转速=温度＞装液量＞接种量，综合考虑选取pH、转速和温度作为下一步响应面设计的主要影响因素。其余因素选值根据各自效应值的正负及大小来确定，正效应取其较大值，负效应取其较小值。

表3　Plackett-Burman试验显著性分析Table 3 Significance analysis of Plackett-Burman experiments

2.2.2最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验结果选取3个重要因子，即pH、转速和温度来设计显著因素的最陡爬坡路径及步长，最陡爬坡试验设计及结果见表4。由表4可知，随着3个显著因素的变化，菌株发酵粗酶液的酶活力在pH 5.5、转速140 r/min和温度22℃出现最高值，故选择此条件作为响应面的设计中心。

表4　最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and results of the steepest ascent path experiments

2.2.3Box-Behnken设计及结果

根据最陡爬坡试验确定影响菌株Rhodotorulasp. CD-008产酶的显著因素及各自的取值，进行Box-Behnken试验设计，Box-Behnken试验设计与结果见表5，回归模型方差分析见表6。

运用Design-Expert8.6.0.1软件对表5中的数据进行回归分析，得到SOD酶活力（Y）和发酵条件的二次回归模型方程如下：

由表6可知，除X1X3项外，X1X3和对SOD酶活力具有显著影响（P＜0.05），其他项对SOD酶活力均具有极其显著影响（P＜0.001），说明转速与pH和温度交互项对酶活有显著性影响，而pH与温度交互项对酶活没有显著性影响。回归模型的决定系数R2=0.9974，校正决定系数说明该模型只有0.72%的变异不能由该模型解释，因此，该模型的拟合性较好。模型P值（＜0.000 1）远远＜0.001，说明该模型是极其显著的，失拟项数值为0.097 3＞0.05说明失拟不显著，模型稳定，设计可靠，可用于菌株Rhodotorula sp.CD-008酶活的分析与预测。通过回归模型方程构建pH、转速和温度对菌株Rhodotorulasp.CD-008产SOD酶活力影响的响应曲面和等高线结果见图2。

表5　Box-Behnken试验设计与结果Table 5 Design and results of the Box-Behnken experiments

表6　回归方程的方差分析Tabble 6 Variance analysis of regression equation

由图2可以较直观地看出曲面图为椭圆形或马鞍形，说明3因素两两之间的交互作用对酶活的影响情况［17-18］，根据Design-Expert软件进行分析，可得其最佳发酵条件为pH 5.34、转速150 r/min、温度21.37℃。初始发酵条件下粗酶液的酶活力为4 189.58 U/g湿菌体，在此条件下，粗酶液的酶活力为6 430.52 U/g湿菌体，是优化前酶活的1.53倍。并且优化后粗酶液酶活力的测定值与预测值6 348.66 U/g湿菌体非常接近，说明模型的设计是合理有效的。

图2　pH、转速与温度交互作用对SOD酶活力影响的响应曲面和等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between pH，rotate speed and temperature on SOD enzyme activity

2.3SOD分离纯化结果

2.3.1SOD分离纯化结果

经65%硫酸铵盐析、超滤离心和SephadexG-100凝胶过滤层析后，SOD的纯化结果见表7。由表7可知，Rhodotorulasp. CD-008 SOD酶发酵粗酶液经盐析、超滤离心和层析后，SOD的比酶活达到419.90 U/mg，蛋白回收率为8.2%，纯化倍数为9.60。

表7　Rhodotorulasp.CD-008 SOD的纯化结果Table 7 Purification results ofRhodotorulasp.CD-008 SOD

2.3.2SOD分子质量的测定结果

图3　SOD的SDS-PAGE电泳图Fig.3 SDS-PAGE electrophoretogram of SOD

提纯后的SOD SDS-PAGE凝胶电泳图谱见图3。由图3可知，SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的SOD酶为单一条带，分子质量约为37.5 ku，据何献君等［19］研究报道，Cu/Zn SOD的分子质量在32～65 ku之间，推断该SOD类型可能为Cu/Zn SOD。

3　结论

本研究采用Box-Behnken试验设计，对Rhodotorulasp. CD-008产超氧化物歧化酶的发酵条件进行了优化，经软件Design-Expert分析，结果表明，最优发酵条件为pH 5.34、转速150 r/min、温度21.40℃，在此最优条件下，SOD酶活力为6 430.52 U/g湿菌体比优化前提高了1.53倍。孙怡等［20］筛选出两株产SOD乳酸菌菌株L-7、L-9，经优化后SOD酶活分别达到3 361.2U/g和3 389.7 U/g；丁琳等［21-22］分别选育出高产SOD的枯草芽孢杆菌，酶活达2 186 U/g湿菌体、3 439.3 U/g湿菌体，据文献报道，真核生物中的SOD含量远远高于原核生物的SOD含量［23-24］，而本研究优化胶红酵母CD-008产SOD发酵条件后，酶活达6 430.52 U/g湿菌体，也验证了这一说法。

Rhodotorulasp.CD-008发酵粗酶液经过饱和度65%硫酸铵盐析、超滤离心、SephadexG-100凝胶过滤层析等纯化步骤，得到的SOD比酶活达到419.90 U/mg，纯化倍数为9.60倍，蛋白回收率为8.2%。SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的SOD为单一条带，分子质量约为37.5 ku，推断可能为Cu/Zn SOD。本研究中，对胶红酵母Rhodotorulasp. CD-008进行发酵条件优化，为SOD的生产增添了新的途径，对于抗癌、抗炎药物的合成，食品添加，化妆品添加等各行业的应用，均具有广泛而深远的意义。同时也为该菌超氧化物歧化酶的酶学性质，分子水平诱变以及工业深层发酵、基因序列、氨基酸序列等进一步深入研究奠定基础。

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Optimization of fermentation conditions of SOD-producingRhodotorulasp. CD-008 and separation and purification of the SOD

JIN Liandou1，2，LI Xiaoyan1，2*，WANG Xiaohui1，2，CHI Naiyu1，2，ZHANG Qingfang1，2，ZHANG Xujiao1，2，WANG Qiang1，2
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，Dalian 116622，China）

On the basis of single factor experiments，the optimum fermentation conditions of SOD-producingRhodotorulasp.CD-008 were determined by Plackett-Burman，Box-Behnken design and response surface analysis，and the separation and purification conditions of SOD were research by salting out，ultrafiltration centrifugation and Sephadex G-100 gel filtration chromatography.Results indicated that pH，rotate speed and temperature had a significant effect on enzyme activity.The optimum fermentation conditions was pH 5.34，rotate speed 150 r/min and temperature 21.40℃. Under the conditions，the enzyme activity in fermentation liquor was 6 430.52 U/g fresh cells，which was 1.53 times higher than that before optimization.The crude enzyme liquid was purified by ammonium sulfate with degree of saturation 65%，ultrafiltration centrifugation and Sephadex G-100 gel filtration chromatography，specific enzyme activity of SOD obtained was 419.90 U/mg，purification fold was 9.60 and protein recovery rate was 8.2%.SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular weight of SOD purified was about 37.5 ku.

Rhodotorulasp.CD-008；superoxide dismutase；fermentation conditions；separation and purification

Q936

0254-5071（2016）03-0017-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.005

2015-12-27

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2014AA093512）

金连豆（1991-），女，硕士研究生，研究方向为微生物与酶工程。

李晓艳（1972-），女，讲师，硕士，研究方向为微生物工程应用技术开发。