水牛乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

唐　艳，谢　芳，杨承剑，农皓如，冯　玲，曾庆坤（中国农业科学院 广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

水牛乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

唐艳，谢芳*，杨承剑，农皓如，冯玲，曾庆坤
（中国农业科学院 广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

从生水牛乳中筛选出两株高产胞外多糖（EPS）的乳酸菌株LB2、LB7，经MRS肉汤培养基发酵后，菌液中的胞外多糖（EPS）产量分别达135 mg/L、148 mg/L，通过形态学、生理生化特征、API细菌鉴定系统、16S rRNA序列分析，鉴定出菌株LB2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），LB7为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。将其应用到水牛乳酸奶的发酵中，结果表明，植物乳杆菌LB2和类肠膜魏斯氏菌LB7均可用来发酵水牛乳酸奶，且能有效增加酸奶的黏度和胞外多糖产量，其黏度和EPS产量分别为4 050 mPa·s和149 mg/L。

乳酸菌；胞外多糖；筛选；菌种鉴定

乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的黏液多糖或荚膜多糖，属于微生物胞外多糖的一种［1］。酸奶是以鲜奶或乳制品为原料，经均质（或不均质）、杀菌、冷却后加入特定微生物发酵剂、保温发酵而制成的产品。酸乳在生产过程中乳酸菌会产生一种多糖类物质，即乳酸菌胞外多糖［2］。乳酸菌胞外多糖可赋予酸乳特殊的质构和风味，如增加酸乳的黏性和流变性、提高酸乳的持水性防止乳清析出、增强凝乳强度、增加酸乳的口感等［3］。因乳酸菌是食品级微生物生产菌，相较其他菌安全性高，所以近年来乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多，各国科学家试图用基因工程的手段构建高产胞外多糖菌株，但至今仍未成功。目前用于发酵酸乳的菌株产胞外多糖量很低，远不能满足生产所需［4］。因此高产胞外多糖乳酸菌的筛选、工艺的优化等仍是当下研究的热点。水牛乳作为我国南方地区特有的乳制品，其营养价值颇高，本试验从生鲜水牛乳中筛选出10株乳酸菌，对其进一步分离纯化，从中筛选出2株高产胞外多糖的乳酸菌，并对其进行了种属分类鉴定，旨为将此类高产胞外多糖乳酸菌应用到水牛乳酸奶发酵中，并研制出富含EPS的水牛乳酸奶，为今后水牛乳高附加值功能性产品的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜水牛奶：取自水牛研究所种牛场；API50CH、API50 CHL试剂：法国梅里埃公司。

乳酸菌分离培养基：含20 g/L CaCO3的MRS固体培养基；菌种活化培养基为体积分数10%的脱脂水牛乳；MRS培养基：北京陆桥公司；MRS肉汤培养基：广东凯环生物科技公司。

葡萄糖、蔗糖：苏州正洋化工科技有限公司；30%过氧化氢：天津市科密欧化学试剂有限公司；G1060革兰氏染色试剂盒：北京索宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

SPX-150生化培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；YM50立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器材有限公司；5804R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；JD500-2型电子天平：梅特勒-托多利仪器有限公司；LNG-T88台式快速冷冻离心机：上海赵迪生物科技有限公司；722可见光分光光度计：上海光学仪器厂；尼康ECLIPSE 50i正置生物显微镜：Nikon日本公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；THZ-82A恒温振荡器：北京国华科技集团有限公司；NDJ-1型旋转黏度计：上海精科实业有限公司；TMS-Pro质构仪（食品物性分析仪）：美国FTC公司；HI8424便携式pH检测仪：意大利HANNA（哈纳）公司；乳脂分离机：北京夏音嘉塑科技有限公司；BCD-246WTM冰箱：美的集团。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分离纯化

无菌条件下，将新鲜水牛乳进行梯度稀释后涂布于含20 g/L CaCO3的MRS平板上，于37℃培养24 h。挑取肉眼可见、生长较快、单个有溶钙圈、呈黏液状的菌落，分离并纯化，根据菌落特征进行初步归类，将革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株作为进一步筛选的乳酸菌待选菌株，经反复划线分离培养，直至获得纯菌落为止，将其编号后于4℃保存备用。

1.3.2产胞外多糖乳酸菌的筛选

将上述备用乳酸菌分别接种于灭菌后的全脂水牛乳中，37℃增菌培养活化，再以5%体积量分别转接入20 mL灭菌水牛乳中，每菌株2个平行样，37℃培养24 h。

1.3.3产胞外多糖乳酸菌的鉴定

菌株的形态及生理生化鉴定：将分离保存的菌种划线于MRS固体培养基上，观察菌落形态及大小、颜色、边缘及隆起状况，在生化显微镜下观察革兰氏染色后的菌体形态特征。并考察菌株的生长温度（4℃、10℃、15℃、45℃）、耐酸碱性（37℃条件下pH 4.5及pH 9.6）以及耐盐性（37℃条件下NaCl 6.5%及18%，在此条件下能生长），同时进行接触酶实验、淀粉水解实验、明胶液化实验及碳水化合物发酵实验等生理生化实验［5］。

菌株的API试剂鉴定：采用API细菌鉴定系统对未知产EPS的株乳酸菌进行鉴定。取适量经过活化后的菌液于API 50 CHL液体培养基中，摇匀，接入API 50 CH试剂条中，用灭菌后的液体石蜡封口，30℃培养24 h或48 h观察试剂条颜色的变化，最后通过API LAB Plus V5.0软件鉴定菌种。

1.3.4含EPS水牛乳酸奶的制作及其pH和黏度的测定

全脂水牛乳于95℃条件下灭菌12 min，冷却至37℃，无菌条件下，按8%接种量分别接种活化好的产EPS乳酸菌菌种，于42℃发酵至凝固，置4℃冰箱后熟24 h备用。分别记录其凝乳时间，观察其色泽及组织状态，并测定酸奶的pH和黏度［6-7］。

1.3.5测定方法

黏度的测定：NDJ-1型旋转黏度计，采用3号转子，30转/min，黏度计算公式为：η=K·α，其中，η为黏度，K为系数，α为指针所指读数（偏转量）。

样品EPS产量的测定：采用苯酚-硫酸法［8］测定发酵乳中EPS的含量。取10 mL纯菌株发酵乳样品，加入5 mL体积分数为80%的三氯乙酸，12 000 r/min离心40 min，除去菌体和蛋白，将离心后的上清液装入透析袋中流水透析48 h。透析液中加入3倍体积的体积分数为95%的乙醇，在4℃冷藏过夜，多糖呈现絮状沉淀析出，4℃、10 000 r/min离心20 min，除上清液，得到沉淀后的胞外多糖［9］。将胞外多糖溶于10mL蒸馏水中，得到EPS的水溶液。取2 mL样品液于25 mL比色管中，加入6%的苯酚2 mL，再加入10 mL浓硫酸，在波长625 nm处测定吸光度值，以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线［10］。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线的绘制

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.887 8x-0.022 8，相关系数R2=0.998 7，表明葡萄糖质量浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2乳酸菌的分离及其菌落特征、细胞形态

本试验共分离了10株乳酸菌，因乳酸菌在生长过程中产酸较多，故在添加了CaCO3的MRS平板上，菌落周围有较清晰的溶钙圈，一般乳球菌表面光滑，边缘整齐，呈圆形，凸起，灰白色或白色；乳杆菌表面呈雪花状，半透明，扁平，白色或灰白色，有黏性，菌落形态见图2。经革兰氏染色，镜检观察，10株初筛乳酸菌中有2株球菌，编号LB1～2，8株杆菌，编号为LB3～10，乳杆菌的细胞形态为长杆状或短杆状，大多呈短链或长链排列；乳球菌多为圆形，以单生或短链状排列，无鞭毛，不运动；其细胞形态杆菌与球菌各取一株典型菌株进行镜检，结果如图3所示。

图2　乳酸菌LB2在MRS平板上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of lactic acid bacteria LB2 in MRS tablet

图3　初筛乳酸菌的细胞形态Fig.3 Cell morphology of preliminary screened lactic acid bacteria

2.3高产EPS乳酸菌菌株的筛选

将分离所得的10株未知乳酸菌活化后，接种到MRS肉汤培养基中，37℃培养24 h，测定其EPS产量，以取高产胞外多糖的乳酸菌作为下一步优选菌株鉴定作参考。结果如表1所示。

表1　分离乳酸菌菌液的EPS产量Table 1 EPS production of separated lactic acid bacteria liquid

由表1可知，在同等底物和培养条件下，10株乳酸菌均能产EPS，且不同乳酸菌菌液EPS产量不同，其中LB2和LB7产量最高，分别为135 mg/L和148 mg/L。因此，选择菌株LB2及LB7作进一步鉴定。

2.4高产EPS乳酸菌菌种的鉴定

参照文献［11-12］，对分离出的10株乳酸菌中产EPS最高的LB2和LB7两株菌进行生理生化实验，借助API鉴定系统，结果见表2。

表2　两株高产EPS乳酸菌的生理生化鉴定结果Table 2 Physiology and biochemistry identification results of two strains of high yield EPS

从表2菌株的生化实验结果可看出，LB2、LB7的各项检测特征分别符合《常见细菌系统鉴定手册》中关于植物乳酸杆菌和魏斯氏菌的描述，后又通过16S rRNA序列测定［13］，其鉴定结果：菌株LB2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），LB7为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesen teroides）。

2.5高产EPS乳酸菌的发酵性能

将已鉴定的、产EPS最高的两株LB2和LB7作为目标菌种来发酵水牛乳，并随机选择之前分离出的产EPS较低的菌株LB1及LB8作为对照，测定其水牛乳酸奶的pH值、凝乳时间、黏度及EPS产量，结果如表3所示。

表3　产EPS乳酸菌发酵水牛乳特性Table 3 Characteristics of buffalo milk fermentation by EPS producing lactic acid bacteria

由表3可知，产EPS的这4株乳酸菌均在11～12 h内达到发酵终点，各菌株发酵水牛乳酸奶的pH值均在3.80左右，说明其产乳酸能力相差不大。但是这4种发酵乳的黏度及EPS产量差异较大，LB7发酵的水牛乳酸奶黏度及EPS产量最大，分别为4 050 mPa·s、149 mg/L；LB2次之，分别为3 970 mPa·s、142 mg/L；LB8最小，说明酸奶在发酵过程中，菌体通过不断分泌胞外多糖来使水牛乳酸奶的黏稠度增加，这与表3中发酵水牛乳的黏度与EPS产量呈正相关一致。乳酸菌所产生的胞外多糖对酸奶的质地黏度、口感及乳清析出都具有重要意义，同时也是评定酸奶感官品质的一个重要指标［14］，亦可作为天然增稠剂和稳定剂来使用，具有较好的经济效益。

3　结论

试验通过涂布平板、斜面划线从生水牛乳中分离纯化出10株乳酸菌，用MRS肉汤活化培养后，均能发酵产胞外多糖（EPS），其中LB2和LB7菌株产量最高，分别达135mg/L、148 mg/L。

通过生理生化实验、API细菌鉴定系统、16Sr RNA序列分析鉴定两株高产EPS菌株：LB2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），LB7为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。

将菌株LB2和LB7分别用来发酵水牛乳酸奶，通过检测其黏度、pH、EPS产量，进一步证实了LB2和LB7具有高产EPS和优良的发酵性能。

乳酸菌胞外多糖能赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，因能起到安全食品添加剂的作用，而广泛用于食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及持水等方面［15］。本研究将从水牛乳中分离出来的产EPS乳酸菌应用到酸奶的发酵中，以制备出高产EPS的水牛乳酸奶，为今后水牛乳高附加值功能性产品的开发提供理论依据。

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Screening and identification of lactiv avid bacteria with hiht yield extravellular polysaccharides

TANG Yan，XIE Fang*，YANG Chengjian，NONG Haoru，FENG Ling，ZENG Qingkun
（Guangxi Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China）

Two lactic acid bacteria strains LB2 and LB7 with high yield extracellular polysaccharides（EPS）were screened from raw buffalo milk.After fermentation in MRS medium，the EPS production in fermentation broth was up to 135 mg/L and 148 mg/L，respectively.Through strains morphological，physiological and biochemical characteristics identification，API bacteria identification system，16S rRNA sequence analysis，the strain LB2 was identified asLactobacillus plantarum，LB7 was identified asWeissella paramesenteroides.The strains were applied to the buffalo milk fermentation，the results showed that LB2 and LB7 were available to ferment milk yogurt，and can effectively increase the viscosity of yogurt and extracellular polysaccharide production.The viscosity and EPS yield of the yogurt was 4 050 mPa·s and 149 mg/L，respectively.

lactic acid bacteria；extracellular polysaccharides；screening；strain identification

Q939

0254-5071（2016）02-0070-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.016

2015-12-04

广西水牛研究所基本科研业务费项目（水牛基1504011）

唐艳（1978-），女，助理研究员，本科，研究方向为乳品加工。

谢芳（1980-），女，实习研究员，本科，研究方向为乳品科学与食品微生物技术。