产吡嗪类细菌的麸曲制作工艺优化

武　顺，王德良，闫寅卓（中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

产吡嗪类细菌的麸曲制作工艺优化

武顺，王德良，闫寅卓*
（中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

该文采用响应面法对产吡嗪细菌的麸曲制作工艺进行研究。以从酒曲中筛选的细菌为基础，考察不同因素对细菌产吡嗪的影响。采用单因素试验和响应面法对影响麸曲制作中细菌产吡嗪的4个主要影响因素即麸皮添加量、水分、培养时间和接种量进行分析优化。结果表明，影响细菌产吡嗪的工艺因素按主次顺序排列为麸皮添加量＞接种量＞水分含量＞培养时间；确定麸曲制作中细菌产吡嗪的最佳工艺条件为麸皮添加量115 g、水分含量30%、培养时间36 h、接种量12%。在此最佳条件下，吡嗪类物质的产量36.36×10-5g/g。

吡嗪；响应面法；工艺优化

吡嗪类化合物是1、4位含两个氮杂原子的六元杂环化合物，具有气味强度高、阈值低、风味独特、特殊药理功能和保健功能等特点，广泛存在于天然和发酵食品中［1］。其具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气，香气透散性好，对其他香味有显著的烘托和叠加作用［2-3］。研究表明，吡嗪类化合物尤其是四甲基吡嗪，具有扩张血管、改善血循环、护肝（防止酒精对胃黏膜和肝脏的损伤）等功能［4-5］。

国内外的相关研究结果表明，产吡嗪、特别是四甲基吡嗪的杆菌主要集中在枯杆菌及其突变株［6］、乳酸杆菌［7］、枯草芽孢杆菌［8］等杆菌属，国内的一些学者通过筛选高产蛋白酶活性［9-11］的菌株得到高产吡嗪类的菌株。KOSUGE T等［12］在纳豆中分离得到四甲基吡嗪，发现枯草芽孢杆菌具有发酵产生四甲基吡嗪的能力。ZAK D L等［13］从发酵可可豆中找到了发酵产吡嗪的枯草芽孢杆菌，且只有在枯草芽孢杆菌生长时，体系中才会有四甲基吡嗪。HUANG T C等［14］考察了乙偶姻/乙酸铵模型体系中四甲基吡嗪的生成过程，并提出了弱酸高压条件下四甲基吡嗪的生成机制。唐清兰等［15］对剑南春酒曲中筛选产吡嗪类功能菌株的产吡嗪条件进行优化。祝赛峰等［16］利用响应面法优化枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪的培养条件。朱兵锋等［17］通过两阶段pH控制策略、葡萄糖补加策略对微生物发酵生产吡嗪进行优化。

本试验以从酒曲中筛选的高产吡嗪类的细菌为基础，对其麸曲应用中产吡嗪类物质量进行试验优化，对该菌种的实际应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

高产吡嗪类物质的细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：本实验室从酒曲中筛选。

基础培养基（营养肉汤培养基）：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L。

发酵培养基：葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、氯化锰0.05 g/L、氯化镁0.15 g/L、氯化锌0.1 g/L、氯化铁0.05 g/L。

基础麸曲培养基：麸皮100 g、水分含量40%。

1.2仪器与设备

Glarus 600气相色谱质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美国PerkinElmer公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DHZ-B高温全温振荡器：太仓市豪成试验仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1单因素试验设计

种子液的制备：将枯草芽孢杆菌挑取一环接于基础培养基中，37℃、180 r/min培养1 d后转接到发酵培养基中相同条件下培养。

麸皮添加量的确定：麸皮添加量分别为60g、70g、80g、90 g、100 g、110 g、120 g、130 g、140 g，水分含量40%，接入10%种子液，装入500 mL三角瓶中，37℃培养48 h。培养好的麸曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麸曲，加入内标5 μL，饱和NaCl 5 mL后测定吡嗪类物质含量。

水分含量的确定：水分含量按20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%添加，麸皮添加量100 g，接入10%种子液，装入500 mL三角瓶中，37℃培养48 h。培养好的麸曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麸曲，加入内标5 μL，饱和NaCl 5 mL后测定吡嗪类物质含量。

培养时间的确定：培养基中加入麸皮100 g，水80 mL，装入500mL三角瓶中，接入10%种子液，37℃分别培养12h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h。培养好的麸曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麸曲，加入内标5 μL，饱和NaCl 5 mL后测定吡嗪类物质含量。

接种量的确定：接种量按5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%添加到培养基中，麸皮量100 g，水分含量40%，装入500 mL三角瓶中，37℃培养48 h。培养好的麸曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麸曲，加入内标5 μL，饱和NaCl 5 mL后测定吡嗪类物质含量。

1.3.2响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以麸皮添加量（A）、水分含量（B）、培养时间（C）、接种量（D）为考察因子，以吡嗪类物质含量（Y）为响应值，利用Design-Expert8.05中的Box-Behnken Design进行响应面试验设计，因素与水平编码值见表1。

表1　Box-behnken试验编码与水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken experiment

1.3.3测定方法

吡嗪类物质含量测定采用气质联用法进行测定。

样品处理：取样品0.5 g，加入内标5 μL、饱和NaCl 5 mL，50℃顶空固相萃取30 min。

气相色谱条件：DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）气相色谱。进样口温度250℃，载气He，流速2mL/min。进样量1 μL，不分流进样。升温程序为35℃，保持4 min，再以5℃/min的速度升温至150℃，保持4 min再以3℃/min的速率升温至220℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，激活电压1.5 V，质量扫描范围30.00～350.00 m/z。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1麸皮添加量对吡嗪类物质含量的影响

麸皮添加量对吡嗪类物质含量的影响见图1。

图1　麸皮添加量对吡嗪类物质含量的影响Fig.1 Effect of bran addition on pyrazine content

由图1可知，随着麸皮添加量的增加，吡嗪类物质含量呈现出先增加后降低的趋势，麸皮添加量为100 g时吡嗪类物质含量最高，为32.213 1×10-5g/g。因此选择麸皮添加量100 g为响应面设计中心点。

2.1.2水分含量对吡嗪类物质含量的影响

水分含量对吡嗪类物质含量的影响结果见图2。

图2　水分含量对吡嗪类物质含量的影响Fig.2 Effect of water content on pyrazine content

由图2可知，随着水分含量的增加，吡嗪类物质含量呈现出先增加后降低的趋势，水分含量为40%时吡嗪类物质含量最高，为28.734 6×10-5g/g。因此选择水分含量40%为响应面设计中心点。

2.1.3培养时间对吡嗪类物质含量的影响

培养时间对吡嗪类物质含量的影响结果见图3。

图3　培养时间对吡嗪类物质含量的影响Fig.3 Effect of culture time on pyrazine content

由图3可知，随着培养时间的增加，吡嗪类物质含量呈现出先增加后降低的趋势，培养时间为48 h时吡嗪类物质含量最高，为31.021 9×10-5g/g。因此选择培养时间48 h为响应面设计中心点。

2.1.4接种量对吡嗪类物质含量的影响

接种量对吡嗪类物质含量的影响见图4。

图4　接种量对吡嗪类物质含量的影响Fig.4 Effect of inoculum on pyrazine content

由图4可知，随着接种量的增加，吡嗪类物质含量呈现出先增加后降低的趋势，接种量为15%时吡嗪类物质含量最高，为36.272 5×10-5g/g。因此选择接种量15%为响应面设计中心点。

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

响应面试验设计及结果见表2，回归模型方差分析结果见表3。

由表3可知，P值＜0.05即为显著。方差分析结果可见，模型显著，AC、BC、CD、A2、C2、D2均为显著（P＜0.05），失拟项不显著，说明该模型适合对该试验进行分析。试验各因素对吡嗪类产量的影响程度由大到小依次为A（麸皮添加量）＞D（接种量）＞B（水分含量）＞C（培养时间）。

通过分析得到编码后4个因素与吡嗪类含量拟合成的多元二次方程为：

表2　Box-behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3响应面分析与优化

根据回归方程绘制响应面分析图，以确认麸皮添加量、水分含量、培养时间、接种量对吡嗪类物质含量的影响，响应面曲面和等高线见图5。

图5　麸皮添加量、水分含量、培养时间、接种量交互作用对吡嗪类物质含量影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction betueen bran addition，water content，inoculum on pyrazine content

由图5可知，麸皮添加量与水分含量交互作用、麸皮添加量与培养时间交互作用、麸皮添加量与接种量交互作用、水分含量与培养时间交互作用、水分含量与接种量交互作用、培养时间与接种量交互作用的显著性情况与表3中交互项P值的分析结果一致。

响应面的坡度较为陡峭，表明吡嗪类的产量对麸皮添加量和水分含量、麸皮添加量和培养时间、麸皮添加量和接种量、水分含量和培养时间、水分含量和接种量、培养时间和接种量的变化较为敏感。在麸皮量不变的条件下，随着水分含量水平的逐渐提高，吡嗪类产量呈先上升后下降的变化趋势；在水分含量不变的条件下，随着麸皮量的逐渐增加，吡嗪类产量呈先上升后下降的趋势，且变化较大，其他交互因素同上。

等高线呈圆形，表明两因素之间的交互作用强度较弱，影响不显著。等高线圆形，表明两因素之间的交互作用强度较强，影响显著。

通过Design Expert（v8.0.6）软件分析，制作麸曲的最佳条件为麸皮量114.61 g、水分含量30%、培养时间36 h、接种量12%，此条件下吡嗪类产量的理论值为36.5473×10-5g/g。

考虑到实际操作方便性，将麸皮添加量定为115 g。故本试验所得最佳条件为麸皮量115 g、水分含量30%、培养时间36 h、接种量12%。

2.3回归模型的验证试验

为检测所得结果的可靠性，对上述优化条件进行3次平行试验，即麸曲量115g、水分含量30%、培养时间36 h、接种量12%，实际测得的平均吡嗪类产量为36.3645×10-5g/g，理论值与试验值的相对偏差为0.497%，证明应用响应曲面法优化细菌产吡嗪类的培养条件是可行的。

3　结论

本试验通过单因素试验分析了培养条件对吡嗪类产量的影响，并结合Box-Behnken设计及响应面分析，建立了二次多项式模型，并经显著性检验证明了该模型具有可靠性。所得二次回归方程为：Y=34.76+0.59A+0.28B-0.16C-0.38D-0.46AB-2.23AC-0.11AD+1.65BC+0.45BD+2.14CD-2.89A2-0.51B2-1.80C2-1.40D2。得到最佳发酵条件为麸曲量115 g、水分含量30%、培养时间36 h、接种量12%。在此条件下，吡嗪类物质含量为36.3645×10-5g/g。

［1］SEITZ E W.Bioprocess production of flavor，fragrance，and color ingredients［M］.New York∶Wiley，1994.

［2］吴建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代谢机理研究［D］.无锡：江南大学博士论文，2013.

［3］周永妍，李亚，余爱农.顶空固相微萃取法萃取Maillard反应体系中吡嗪类化合物的条件优化［J］.食品科学，2015，37（6）：119-123.

［4］赵德义，汤丹丹，曹建全，等.产四甲基吡嗪微生物菌株的选育［J］.中国酿造，2015，34（3）：103-106.

［5］张世仙，金茜，曾启华，等.茅台酱香型酒糟香气成分分析［J］.中国酿造，2012，31（1）：188-189.

［6］XIAO Z J，XIE N Z，LIU P H，et al.Tetramethylpyrazine production from glucose by a newly isolatedBacillusmutant［J］.Appl Microbiol Biot，2006，73（3）∶512-518.

［7］KIM K S，LEE H J，SHON D H，et al.Optimum conditions for the production of tetramethylpyrazine flavor compound by aerobic fed-batch culture ofLactococcus lactissubsp.Lactisbiovar.Diacetylactis FC1［J］.J Microbiol Biotech，1994，4（4）∶327-332.

［8］刘露，李丽，闫洪雪，等.一株苹果内生枯草芽孢杆菌BS10的发酵条件优化研究［J］.现代农业科技，2015（23）：131-132，139.

［9］庄名扬，王仲文，孙达孟，等.美拉德反应与酱香型白酒［J］.酿酒，1999（4）：44-46.

［10］王庆国，刘天明，韩小龙，等.两株产果香菌株的初步鉴定及香味成分分析［J］.食品研究与开发，2007，28（6）：16-19.

［11］成堃，路福平，李玉，等.产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究［J］.中国酿造，2009，28（2）：33-36.

［12］KOSUGE T，KAMIYA H.Discovery of a pyrazine in a natural product-tetramethylpyrazine from cultures of a strain ofBacillus subtilis［J］. Nature，1962，193（4817）∶776-776.

［13］ZAK D L，OSTOVAR K，KEENEY P G.Implication ofBacillus subtilis in the synthesis of tetramethylpyrazine during fermentation of cocoa beans［J］.J Food Sci，1972，37（37）∶967-968.

［14］HUANG T C，FU H Y，HO C T.Mechanistic studies of tetramethylpyrazine formation under weak acidic conditions and high hydrostatic pressure［J］.J Agr Food Chem，1996，44（1）∶240-246.

［15］唐清兰，徐姿静，徐占成，等.剑南春酒体风味物质吡嗪类生成功能菌株的选育［J］.酿酒，2013（3）：23-27.

［16］祝赛峰，吴建峰，赵锡荣，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪的培养条件［J］.食品科学，2014，35（9）：218-223.

［17］朱兵峰.枯草杆菌两步法生产四甲基吡嗪的调控及机制的研究［D］.无锡：江南大学博士论文，2010.

Optimization of Processing technology of Fuqu with pyrazine-producing bacteria

WU Shun，WANG Deliang，YAN Yinzhuo*
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

The process of pyrazine-producing bacteria used inFuquwas studied.The bacteria were screened from differentDaqu，and the effect of different factors on pyrazine production was investigated.The effects of bran addition，water content，culture time and inoculum were investigated by single factor and response surface experiments during the production ofFuqu.The results showed that the factors affecting pyrazine production in order was bran addition，inoculum，water content and culture time.The optimal processing condition was bran 115 g，water content 30%，culture time 36 h and inoculum 12%.Under the optimized condition，the pryzine production was 36.36×10-5g/g.

pyrazine；response surface methodology；process optimization

TS201.1

0254-5071（2016）02-0013-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.004

2015-12-03

国家自然科学基金（31401680）

武顺（1987-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

闫寅卓（1986-），女，高级工程师，博士，研究方向为发酵工程。