骨肉瘤中CD133和ALDH1免疫组织化学表达和血管生成增加

钱太保俞 岚张长春周建生

（1蚌埠医学院第一附属医院骨科；2蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠 233003）



骨肉瘤中CD133和ALDH1免疫组织化学表达和血管生成增加

钱太保1*俞 岚2张长春1周建生1

（1蚌埠医学院第一附属医院骨科；2蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠 233003）

目的 检测肿瘤干细胞标记物CD133和ALDH1在骨肉瘤（osteosarcoma，OS）中的免疫组织化学表达及其与微血管密度（microvessel density，MVD）的关系，并分析它们与骨肉瘤患者临床病理参数之间的关系。方法 通过免疫组织化学ElivisionTMplus法检测100例人骨肉瘤标本和20例骨软骨瘤标本（作为对照组）中CD133、ALDH1和CD34蛋白（微血管标志物）的表达。结果 在OS组织中CD133和ALDH1的免疫组织化学染色阳性率明显高于骨软骨瘤组织。CD133和ALDH1的阳性表达率与OS患者术后局部复发与否、肺部转移与否、Enneking分期高低均呈正相关；与OS患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小及组织学类型等无关。MVD计数与OS患者术后局部复发与否、肺部转移与否及Enneking分期均呈正相关。Spearman相关分析发现，CD133和ALDH1的阳性率及MVD计数之间均呈正相关。结论 CD133和ALDH1的表达升高参与OS的浸润、局部复发与转移过程，并可能促进OS组织中的血管生成。

骨肉瘤；CD133；ALDH1；微血管密度；肿瘤干细胞

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是临床常见的、主要发生于青少年的原发性恶性骨肿瘤，也是导致青少年死亡的常见恶性肿瘤［1］。目前，骨肉瘤的治疗方式主要是综合治疗，即术前化疗，手术治疗，术后化疗的模式，可以改善患者的预后［2］，但仍有部分患者因对化疗药产生耐药而导致局部复发或肺转移。越来越多的证据表明，肿瘤干细胞是导致肿瘤复发、转移和放、化疗失败的主要原因［3］。所谓肿瘤干细胞是指肿瘤组织内少量拥有自我更新、促进分化、侵袭和转移能力的细胞群。CD133是最常见的肿瘤干细胞标记物之一，最早是作为造血干细胞表面标记物被发现的，后来在许多恶性肿瘤中均发现有其反常表达。乙醛脱氢酶1（Aldehyde dehydrogenase 1，AL-DH1）是乙醛脱氢酶家族成员之一，其主要作用是促进视黄醛向视黄酸转化，而后者可以引起维生素A代谢相关的细胞增殖与分化，其反常表达，可以促进恶性肿瘤的增殖与侵袭［4-7］。肿瘤干细胞生存的微环境需要大量的微血管和淋巴管［8］，而反映血管生成活性最常用的指标是微血管密度（microvessel density，MVD），其数量的多少与恶性肿瘤的浸润和转移密切相关［9］。尽管TNM分期作为设计OS患者的治疗策略已被广泛接受，但其不能精确地反应OS的生物学行为，因此迫切需要寻找一些新的且能够反映OS生物学行为的生物标记。本研究主要通过免疫组织化学方法检测100例OS组织中CD133、ALDH1和CD34蛋白的表达，分析它们之间的相互关系以及在OS患者中临床意义，旨在找到能够预测OS患者转移与预后的指标。

材料和方法

1 材料

收集安徽省蚌埠医学院第一附属医院病理科2007年1月-2010年12月间存档石蜡包埋OS组织标本100例（活检前未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗，病理确诊后再行术前新辅助化疗、手术、术后化疗等综合治疗）和骨软骨瘤组织标本20例，所有病例均经过本院病理科复查为原发性骨肉瘤。其中男性77例，女性23例；年龄11～48岁，中位年龄19岁。普通型骨肉瘤72例，非普通型骨肉瘤8例；位于下肢有73例，上肢21例，躯干6例；Enneking外科分期：Ⅱ期73例，Ⅲ期27例。肿瘤长径＜5.0cm有45例，≥5.0cm有55例。

2 试剂

鼠抗人单克隆抗体CD133和ALDH1均购自美国Abcam公司；鼠抗人单克隆抗体CD34购自美国Santa Cruz公司；ElivisionTMplus试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

3 免疫组织化学染色

所有的OS标本和对照组标本均经4%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μm连续切片，然后于二甲苯溶液及浓度梯度的乙醇溶液中脱蜡至水洗。免疫组织化学染色方法按ElivisionTMplus试剂盒说明书进行。DAB显色后水洗，然后经苏木素染细胞核、分化、返蓝、脱水透明和树胶封片等。采用PBS液替代一抗作阴性对照，阳性对照为已知的CD133、ALDH1和CD34切片。

4 统计分析

CD133和ALDH1的免疫组织化学结果主要通过着色的强度和范围综合计分得出，即0分为不着色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色；随机选取10个高倍视野，计数阳性肿瘤细胞所占百分比，＜10%为0分，11%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分。两者相乘，得出积分结果，若积分＜3分为阴性，若积分≥3分则为阳性。免疫组化标记结果则由两位病理医师采用独立双盲法来判定。

MVD通过计数10个低倍视野中热点区域的CD34标记阳性小管状结构获得［10］。

所有数据均通过SPSS20.0统计软件进行分析。在OS组中，CD133和ALDH1蛋白的表达以及MVD计数的高低与对照组及各临床病理参数的相关性采用χ2、Spearman等级相关及t检验等，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 OS组织中高表达CD133与OS复发及肺转移正相关

图1　CD133免疫反应性。A，OS组织；B，骨软骨瘤组织；比例尺，50μmFig.1 Immunoreactivity of CD133.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

CD133在对照组中的阳性率为 5.0%（1/20），在OS组中的阳性率为47.0%（47/100）（图1），表达显著升高。CD133蛋白的阳性率与OS患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小及肿瘤类型等均无相关性，但与OS患者术后局部复发与否、肺转移与否及Enneking外科分期等均呈正相关，与肿瘤坏死率呈负相关关系，即CD133的阳性率越高，越易于局部复发和肺转移、Enneking分期和肿瘤坏死率越低（表1）。

表1　OS组织中CD133、ALDH1蛋白的表达和MVD计数与临床各病理参数之间的关系Table 1 Correlation between the expression of CD133、ALDH1 and the scores of MVD and clinicopathological characteristics in OS

2 OS组织中ALDH1表达与OS复发和肺转移正相关

ALDH1蛋白在OS组和对照组中的阳性率分别为52.0%（52/100）和5.0%（1/20）（图2），表达显著高于其在对照组中的表达。随着ALDH1蛋白表达的阳性率越高，OS越容易发生局部复发、肺转移、Enneking分期越高和化疗后肿瘤越难发生坏死。ALDH1蛋白的阳性率与OS患者的年龄、性别、肿瘤位置等均无相关性，与肿瘤大小及肿瘤类型等有关。

图2　ALDH1免疫反应性。A，OS组织；B，骨软骨瘤组织；比例尺，50μmFig.2 Immunoreactivity of ALDH1.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

3 OS组织中MVD计数与其复发和肺转移正相关MVD计数（图3）与OS患者术后局部复发与否、肺部转移与否、Enneking外科分期高低及肿瘤坏死率等均呈正相关关系，与患者的性别、年龄、肿瘤位置等无关，与OS肿瘤大小及肿瘤类型等相关（表1）。

图3　CD34免疫反应阳性微血管。A，OS组织；B，骨软骨瘤组织；比例尺，50μmFig.3 CD34 positive immunoreactive microvessels.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

4 OS组织中CD133、ALDH1的表达和MVD计数之间的关系

Spearman等级相关分析显示CD133蛋白的表达与ALDH1蛋白的表达呈正相关关系；CD133蛋白的阳性率与MVD计数之间呈正相关关系（因MVD的均数为21.2±6.8，故取MVD计数＜21为阴性，≥21时为阳性）；ALDH1蛋白的阳性率与MVD计数之间呈正相关关系（表2）。

表2　OS中CD133、ALDH1和MVD计数之间的相互关系Table 2 The relationship of CD133 and ALDH1 expression and MVD scores in OS

讨 论

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是近年来肿瘤学研究中的热门话题，典型的肿瘤干细胞具有自我更新能力、多向分化潜能、可塑性和耐药性。因此，目前的常规放、化疗等均难以彻底根除肿瘤干细胞，是肿瘤治疗失败的常见原因。在乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤等恶性肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞［11］。CD133是最常见的肿瘤干细胞标记物，又名prominin-1，其分子量为120kDa，是一个拥有5次跨膜结构的糖蛋白。近年来的研究表明，CD133阳性的骨肉瘤细胞具有干性，因此可以作为骨肉瘤干细胞的标记物之一［12］。本研究发现CD133在OS组织的阳性率显著高于其在对照组中的阳性率，且CD133的表达与Enneking分期高有关，意味着CD133阳性表达的OS患者预后可能更差，可能与其CD133阳性的OS细胞较多相关。由于CD133阳性率越高，常规放化疗等治疗后，其残留的干细胞就越多，越易于导致OS患者的局部复发和肺转移。此外，与其他研究相比，本研究还发现，CD133阳性率与肿瘤坏死率呈负相关，说明CD133阳性表达的OS细胞很难被化疗药物杀死。

乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一个位于细胞核、细胞浆和线粒体内酶家族，不仅可以解除细胞醛或药物的毒性，同时也是一个重要的肿瘤干细胞标记物［13-15］。ALDH1是ALDH家族重要成员之一，其位于9号常染色体，有13个外显子。ALDH1可以作为参与氧化视黄醇为视黄酸的酶，也可以促进维生素A相关的细胞增殖与代谢［4-5］。ALDH1过表达能够增加乙醇相关的癌的发病风险［16］。越来越多的证据表明，ALDH1表达反常增高的患者往往意味着其易于转移及预后不良。目前关于ALDH1在OS组织中表达的研究不是很多。在本研究中，我们发现在OS组织中ALDH1的阳性表达率显著高于其在对照组中的阳性率；且随着ALDH1的阳性率增高，OS患者越易于发生局部复发和肺转移，Enneking分期也越高，与国内外文献在其它肿瘤组织中报道的结果相一致［17-18］。ALDH1在OS中的表达意义可能与CD133一样，发挥着其干细胞标记物的作用。

肿瘤的生长和转移都离不开营养和氧。为了满足其生长和转移的需要，肿瘤会通过各种方式来诱导血管形成。当宿主所能提供的营养和氧不能满足其需要时，就会导致肿瘤组织的坏死。MVD是判断血管生成活性最常用指标［19］。在本实验中，我们发现有局部复发和肺转移OS患者其MVD计数显著高于未发生局部复发和肺转移的患者，且MVD计数越高，Enneking分期越高，即MVD计数高的OS患者易于复发、转移，且预后差。

术前化疗后肿瘤坏死率是目前预测OS患者对化疗敏感性的最可靠指标，坏死率高的OS患者其预后较好［20］。本研究还发现100例OS患者中，65例术前化疗后肿瘤坏死率＜90%，35例术前化疗后肿瘤坏死率≥90%。CD133和ALDH1在肿瘤坏死率＜90%组中阳性率分别是60.0%（39/65）和70.8%（46/65），在坏死率≥90%组中阳性率分别为22.8%（8/35）和17.1%，说明肿瘤坏死率高的OS组织CD133和ALDH1的阳性率显著低于其在肿瘤坏死率低的OS组织中的阳性率；而MVD计数在坏死率＜90%组和≥90%组中分别为22.3±6.5和19.1±6.8，也说明坏死率高的OS组织MVD计数显著低于其在坏死率低的OS组织中的计数，提示高表达的CD133和ALDH1及高计数的MVD均有可能会降低化疗的有效率。这可能与CSCs主要居于细胞周期中的G0期（静止期），常规的放、化疗很难有效的杀灭CSCs，所以其坏死率低，从另外一个角度说明CSCs具有天然的抵抗放、化疗特性；而高计数的MVD则进一步加大了杀灭OS细胞的难度。

相关分析发现，在OS组织中，CD133和ALDH1蛋白的表达与MVD计数之间均呈正相关关系。已有的研究表明，肿瘤干细胞生存的微环境中具有大量的微血管和微淋巴管。肿瘤干细胞的存在，可以促进OS逐渐生长。当生长到一定大小时，肿瘤干细胞就会通过各种方式来诱导血管生成，以满足其快速生长所需。由于新生的血管内皮细胞不完善，因此肿瘤细胞很容易通过这些不完善的内皮细胞进入循环系统，最终导致肿瘤的局部浸润和远处转移。近年来的研究也表明，肿瘤干细胞本身也可以形成血管结构［21］。

本研究表明，肿瘤干细胞的存在可能是OS发生的根源，CD133和ALDH1表达的反常增高可能会促进OS的快速增殖，大量新生血管的形成则进一步促进OS的局部浸润和远处转移。因此，CD133、ALDH1的阳性表达和MVD计数可以预测OS的浸润和转移。

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Increase in immunohistochemical expression of CD133 and ALDH1 and angiogenesis in osteosarcoma

Qian Taibao1*，Yu Lan2，Zhang Changchun1，Zhou Jiansheng1
（1Department of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；2Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China）

Objective Objective To explore the expression of CD133 and ALDH1 and the scores of microvessl density（MVD）in osteosarcoma（OS）and their relationship to clinic pathological parameters.MethodsImmunostaining of CD133，ALDH1 and CD34 was performed in 100 cases of osteosarcoma.20 cases of osteochondroma were used as controls.Results The positive rates of CD133 and ALDH1 expression in OS and controls were 47.0%，52.0%vs.5.0%，5.0%，respectively，with significant differences between the two groups.The expression of CD133 and ALDH1 was significantly related with local recurrence，lung metastasis，and Enneking stage of OS patients.There was no significant association between the expression of CD133 or ALDH1 and such characteristics as gender，age，tumor location，tumor diameter，and histological type.The scores of MVD were significantly related with local recurrence，lung metastasis，and Enneking stage of OS patients.Spearman analysis showed that there was a positive association among the expression of CD133，ALDH1 and the scores of MVD.Conclusion High expression of CD133 and ALDH1 is involved in the process of invasion，local recurrence，and metastasis of OS，and may promote angiogenesis.

osteosarcoma；CD133；ALDH1；microvessel density；cancer stem cells

R738.1

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-06 〔修回日期〕2016-03-20

钱太保，男（1976年），汉族，副主任医师

（To whom correspondence should be addressed）：tb197686@126.com