寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗多系统萎缩的临床观察

宫殿荣 于海燕 赵敏 袁晓玲 卢倩



寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗多系统萎缩的临床观察

宫殿荣 于海燕 赵敏 袁晓玲 卢倩

目的 观察寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗多系统萎缩（MSA）的安全性及临床疗效。方法 选取聊城市人民医院神经内科10例MSA患者进行寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗，分别观察治疗后3个月、6个月及1年的UMSARS评分，并随访观察有无不良反应。治疗前后评分比较采用t检验。结果 治疗后3个月的UMSARS partⅠ评分（18.0±6.02）、治疗后6个月的UMSARS partⅠ评分（12.6±4.43）和治疗后1年的UMSARS partⅠ评分（12.3±3.20）均明显低于治疗前（25.8±4.80），治疗后3个月的UMSARS part Ⅱ评分（27.3±8.46）、治疗后6个月的UMSARS partⅡ评分（23.2±7.70）和治疗后1年的UMSARS partⅡ评分（22.4±5.93）均明显低于治疗前（34.5±6.79），治疗后3个月、6个月、1年的UMSARS partⅠ、UMSARS partⅡ评分较治疗前比差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）。除1例患者术后第1天低热，余患者均无不良反应。结论 寰枕间隙侧方穿刺注射脐血单个核细胞治疗MSA是相对安全并且有效的治疗方法。

脐血； 单核细胞； 多系统萎缩； 穿刺术

多系统萎缩（multiple system atrophy，MSA）是一组病因不明的神经系统多部位进行性萎缩的变性疾病［1］。流行病学统计，该病欧美发病率估计为0.6/10万人口，患病率约（1.9 ～ 4.9）/10万人口［2］，中国目前尚无完整的流行病学资料。MSA目前尚无特效疗法，多数患者病情逐渐进展，预后不佳。

脐血是胎儿出生后脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近些年研究发现，从脐血中提取的间充质干细胞是一种多功能干细胞，具备较高的分化潜能，能在特环境的诱导下向多个方向分化，并可分泌多种神经营养因子和生长因子［3-6］，脐血单个核细胞含有脐血间充质干细胞，其脑内移植可存活并能减轻脑损伤［7］，并有神经保护及修复神经损伤的作用［8-10］。

本研究自2010年2月至2013年10月对山东省聊城市人民医院神经内科10例确诊的MSA患者进行寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗，取得了良好的疗效。

资料与方法

一、资料

1.临床资料:2010年2月至2013年10月在山东省聊城市人民医院神经内科确诊的MSA患者10例，进行非随机自身对照研究。其中男性6例女性4例，年龄49～73岁，病程12～40个月，治疗前UMSARS总分评分41～80分。合并有自主神经功能障碍（SDS）的10例，合并帕金森氏综合症（SND）的8例，合并橄榄脑桥小脑萎缩（OPCA）为的3例（表1）。其中8例患者颅脑MR可见不同程度的小脑、脑干萎缩，3例患者颅脑MRT2WI可见典型脑桥“十字征”表现，附1例患者典型MR表现（图1、2）。所有患者均隐匿起病、逐渐加重、无明显家族史。

图1 T2WI矢状位可见桥脑腹侧变平、前后径变窄，小脑脑沟、脑裂变宽，小脑萎缩

表1 10例患者治疗前基本情况、合并症状及UMSARS Part Ⅰ、Ⅱ评分

图2 轴位T2WI可见典型脑桥“十字征”表现，双侧桥臂对称性高信号，第四脑室扩大

2.入选标准:所有患者均按照1998年Gilman等［11］制定的MSA新诊断标准，该标准将疾病临床表现分成三组（自主神经和泌尿功能障碍、帕金森综合征、小脑功能障碍）。

临床诊断标准:（1）自主神经和泌尿功能障碍（Shy-Drager综合征）的诊断标准:直立性低血压（收缩压相差30 mmHg和（或）舒张压相差15 mmHg）和（或）小便失禁；（2）帕金森综合征的诊断标准:运动减少加强直、姿势不稳、震颤中的至少1项；（3）小脑功能障碍的诊断标准:共济失调性构音障碍合并躯干共济失调、肢体性共济失调、侧视性眼球震颤中的至少1项。

3.排除病例:30岁以下发病，相似疾病的家族史，其它原因导致的上述症状体征，痴呆，明显的缓慢垂直扫视或核上性凝视麻痹，存在皮质功能受损症状体征如失语等。

二、方法

（一）治疗方法

对每个患者的治疗方案患者或其委托人知情同意，并签署细胞治疗知情同意书（该技术已通过医院伦理委员会审核）。

1.脐血单个核细胞制备:脐带血由我院产科提供，无菌条件下取正常剖宫产健康产妇志愿捐献的新鲜脐带血约150ml（乙肝七项、HCV、HIV、梅毒等其它相关传染性指标均呈阴性），经院伦理委员会批准，无伦理学争议。在我院中心实验室用脐带血（骨髓细胞）处理试剂盒（加拿大威尔森公司研制，宁夏中联达生物有限公司生产，规格:SCR-200I）分离提取脐血单个核细胞，中心实验室专业人员严格按照试剂盒说明书操作，使得所有的红细胞、血小板、血浆和大部分的白细胞和淋巴细胞被去除，保留几乎所有的单个核细胞，从而得到单核细胞悬液，留取2ml做细胞计数、CD系统检测、细菌培养、内毒素检测。我院干细胞终制品有核细胞存活率大于99%，有核细胞收集计数为（2～3）×108，有核细胞收集率大于85%。

2.脐血单个核细胞注射方法:在消毒的细胞治疗室内，患者仰卧于治疗床，选择并标记穿刺点，局部消毒，铺洞巾，于患者右侧耳后穿刺点进针，经寰枕间隙侧方穿刺，穿刺成功拔出针芯后可见脑脊液流出，将已经复温处理的脐血单个核细胞5ml缓慢注入枕大池，拔出针芯，穿刺点铺贴覆盖。过程中监测患者血压、脉搏、心率、体温等生命体征。

3.治疗周期:每例患者均进行3次治疗，每次间隔1个月。

（二）评价方法

在患者行第1次脐血单个核细胞治疗结束后3个月、6个月、1年进行随访，应用统一MSA评分量表（UMSARS）评分。其中UMSARS PartⅠ评价患者的 Historical Review（病史），总计48分；UMSARS PartⅡ评价患者Motor Examination（运动功能），总计56分。并观察有无不良反应。

（三）统计学分析方法

治疗前后的UMSARS评分结果应用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，多系统萎缩评分（UMSARS）Part Ⅰ及Part Ⅱ以± s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.治疗前后UMSARS PartⅠ、UMSARS Part Ⅱ评分结果（表2～4）

UMSARSⅠ、Ⅱ评分在治疗后3个月、6个月、1年与治疗前比较均P＜0.01，差异有统计学意义，说明脐血单个核细胞移植后患者症状体征明显好转。

表2 10例患者治疗前后UMSARS partⅠ评分

表3　10例患者治疗前后UMSARSpartⅡ评分

表4 治疗前后UMSARS partⅠ、Ⅱ评分比较（±s）

表4 治疗前后UMSARS partⅠ、Ⅱ评分比较（±s）

注:与治疗前比较，aP＜0.05，与治疗后3个月比较，bP＜0.05

分组　UMSARS1　UMSARS2治疗前　25.80±4.80　34.50 ± 6.79治疗后 3 个月　18.00 ± 6.00a　27.30 ± 8.46a治疗后6个月　12.60±4.40ab　23.20±7.70a治疗后1年　12.30 ± 3.20ab　22.40 ± 5.93aF 值　18.01　5.77 P 值　0.00　0.00

其中有1例男性患者在第1次治疗后第3天即出现临床症状的明显好转，该患者治疗前表现为左侧肢体不自主抖动，站立片刻后即出现头晕、心慌，卧位血压130/90mmHg，立位血压80/40 mmHg。治疗3 d后，可行走数十米，无头晕、心慌，卧立位血压无明显差异。其余9例患者平均在第1次治疗后7～10d出现临床症状及体征的不同程度好转。所有患者在治疗3个月后均出现症状体征的明显好转（如小便控制、肢体震颤减轻或消失、共济失调症状消失、未再出现体位性低血压等），在6个月内病情持续好转，有9例患者在治疗后6个月至1年内病情基本保持稳定，2号女性患者在治疗1年后出现症状较治疗后6个月时有反复，该患者治疗前表现为构音障碍、饮水呛咳、行走不稳、小便失禁，UMSARS总分41分，治疗6个月后UMSARS总分16分（饮水呛咳、行走不稳、小便失禁症状消失），在治疗1年后又出现行走不稳，UMSARS总分27分，再行脐血单个核细胞治疗1次，治疗后病情逐渐好转，3个月后随访UMSARS总分20分，患者能进行日常工作至今。

2.治疗后不良反应:仅1例患者治疗后第2天出现发热，体温最高37.5℃，对症治疗后体温恢复正常。余患者在细胞治疗过程中均无特殊不适感，术中及术后24h内持续心电、血氧、脉搏监护示生命体征平稳，无发热，无穿刺点感染、明显出血等，对所有患者定期进行门诊随访，均未出现移植相关并发症。

讨 论

1.MSA作为一个独立的疾病开始于19世纪，该病一般中年起病，每种MSA整合征都有特征性的临床症状，病情慢性进展，各综合征临床症状间可有不同程度交替重叠［11］。MSA是神经变性疾病，基本病理表现包括神经元缺失和角质细胞增生，其发病机制可能与神经元凋亡或酶代谢异常有关［12-13］。其病变部位广泛，损害范围可发生在下橄榄核、脑桥核、小脑、黑质、蓝斑、壳核、苍白球、丘脑底核和胸髓的中间外侧柱、下运动神经元和皮层锥体神经元等处。

MSA隐袭起病，病程进展缓慢，无明显家族史。该病预后不良，晚期主要的临床特征均可出现，目前尚无特效疗法，主要以对症治疗、加强护理为主。

2.本研究对10例MSA患者进行脐血单个核细胞移植后有效率为100%，说明脐血单个核细胞对该病有较好的疗效。

脐血单个核细胞相比其它种类干细胞有材料来源充足、取材方便、增值分化能力强、免疫原性低和无伦理学争议等优点，且不像骨髓间充质干细胞等其他成体干细胞因供体年龄增长出现细胞扩增、分化能力下降的趋势［14-17］。本研究用密度梯度离心法得到的脐血单个核细胞悬液中包含脐血间充质干细胞和造血干细胞，研究表明，间充质干细胞体外培养，可在特定条件下分化为神经干细胞［18］，但这类细胞在体内的分化过程目前尚不清楚。脐血单个核细胞是混合细胞群，其内含有造血干细胞、间充质干细胞、单核细胞等多种细胞成分［19-21］。有动物实验表明，间充质干细胞能定向迁移至受损神经组织并存活，改善神经损伤［22-23］。还有研究表明脐血细胞能够通过调节免疫机制而在脑血管病及神经系统变性疾病中起到治疗作用［24-26］。结合MSA的病理特点及发病机制，推测脐血单个核细胞治疗该病的机理可能为:（1）脐血单个核细胞中的脐血间充质干细胞在脑内可定向分化为神经元细胞和神经胶质细胞，替代和补充病理性神经细胞，使突触和神经网络得以重建。（2）脐血单个核细胞移植可改善脑内微环境，调节免疫机制，促进多种神经营养因子的分泌，如NGF、BDNF等。这些因子通过单独或互相协同作用于神经系统，促进神经细胞修复，上述这种独特的功能也是其他任何一种药物治疗所不能达到的。（3）脐血单个核细胞可减少神经细胞细胞凋亡、促进血管新生及促进轴突髓鞘的修复等。（4）激活内源性神经干细胞，促进内源性神经再生，达到“自我修复”［20-30］。

3.寰枕间隙侧方穿刺术是一种新的临床诊疗穿刺方法，自1990年以来，本人经过反复研究枕大池的解剖特点及具体穿刺部位，并反复多次的在标本上模拟穿刺练习，熟练掌握了寰枕间隙侧方穿刺术的要点、方法后，于1995年将寰枕间隙侧方穿刺术应用于临床，2010年将该技术与干细胞治疗相结合。

寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞较其他移植方法具有以下优势:（1）寰枕间隙侧方穿刺术与腰椎穿刺术相比的优越性在于不须摆放特殊体位，处于平卧位状态，减轻或消除了患者的恐惧感，使患者更愿意接受，且避免腰椎穿刺途径行程长、细胞丢失；（2）寰枕间隙侧方穿刺术与侧脑室穿刺相比的优越性在于:枕大池与四脑室相通，寰枕间隙侧方穿刺到达部位是枕大池，从理论上同侧脑室穿刺有同样的效果。但寰枕间隙侧方穿刺法操作方法简便、创伤小、痛苦小、成功率高，并且因其解剖特点，风险小。而侧脑室穿刺方法存在风险相对较大、操作复杂、患者痛苦大、术后并发症多等缺点，使临床应用受限。

本研究提示，经过治疗的患者神经功能及生活质量近期临床观察均有明显好转，但因为随访时间尚短，病例数少，对该病的远期治疗效果、预后及生存时间有无改善还有待证实，脐血单个核细胞具体的作用机制亦需进一步的研究明确，但寰枕间隙侧方穿刺移植脐血单个核细胞治疗MSA是安全可行及有效的，它为MSA患者带来了希望，为MSA的治疗提供了新的方向。

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（本文编辑:陈媛媛）

Human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation by the side lateral cistern magna puncture for multiple system atrophy patients

Gong Dianrong， Yu Haiyan， Zhao Min， Yuan Xiaolin， Lu Qian. Department of Neurology， Liaocheng People's Hospital， Liaocheng 650011，China
Corresponding author:Gong Dianrong， Email:13346256059@163.com

Objective To investigate the clinical efficacy and safety of human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for multiple system atrophy（MSA）by side lateral cistern magna puncture. Methods 10 MSA patients in the Department of Neurology， Liaocheng People's Hospital were treated by human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation by side lateral cistern magna puncture. The neurological function was assessed 3 months， 6 months and 1 year respectively after treatment through unified MSA rating scale（UMSARS）. Besides， adverse reaction was recorded during the follow-up. Result The scores rated by UMSARS PartⅠat 3 months， 6 months and 1 year after treatment were（18.0±6.02），（12.6±4.43）and（12.3±3.20）respectively， which were significantly lower than those before treatment（25.8±4.80，P＜0.01 for all）. The scores rated by UMSARS PartⅡ at 3 months， 6 months and 1 year after treatment were（27.3±8.46），（23.2±7.70）and（22.4±5.93）respectively， which were significantly lower than those before treatment（34.5±6.79，P＜0.01 for all）. Patients showed no adverse reaction except that one patient had low fever on the first day after transplantation. Conclusion Human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation by the side lateral cistern magna puncture for treatingMSA patients is safe and appears to be beneficial for patients.

Fetal blood； Monocytes； Multiple system atrophy； Punctures

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.008

650011 聊城，聊城市人民医院神经内科

宫殿荣，Emial:13346256059@163.com

2015-09-07）