重复远程缺血后适应对急性缺血心肌中骨髓间充质干细胞移植的影响

蒋钦 向波 于涛 黄克力



重复远程缺血后适应对急性缺血心肌中骨髓间充质干细胞移植的影响

蒋钦 向波 于涛 黄克力

目的 探讨在大鼠急性心肌缺血模型中重复远程缺血后适应对骨髓间充质干细胞（MSC）经心肌注射移植存留率的影响。方法 结扎成年雌性SD大鼠的左前降支诱导心肌缺血。雄性SD大鼠来源的骨髓MSC培养至第三代。大鼠缺血30 min后开放结扎的冠状动脉，并经缺血心肌边缘注射4×106个骨髓间充质细胞。60只心肌缺血大鼠随机平均分为再灌注对照（IR）组、远程缺血后适应（RIPoC）组、重复远程缺血后适应（rRIPoC）组和CXCR4抗体拮抗（CXCR4-Ab）组。远程缺血后适应在后肢上实行4个周期5min缺血和再灌注。重复远程缺血后适应在后肢上每3d实行4个周期5 min缺血和再灌注。CXCR4抗体拮抗（CXCR4-Ab）组在行rRIPoC前经腹腔注射CXCR4特异的抗体。1个月以后，进行心功能评价、免疫组化寻找标记的细胞、聚合酶联反应检测Y染色体拷贝数计算心肌中细胞存留率，采用方差分析和独立t检验进行统计学分析。结果 重复远程缺血后适应的细胞移植组显著改善缺血心脏的左室短轴缩短分数［rRIPoC（25.90±4.33）%，RIPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，F=11.422，P=0.000］和左室收缩末期内径［rRIPoC（5.24±0.51）mm，RIPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，CXCR4-Ab（5.78±0.33）mm，F=8.159，P=0.000］。免疫组化发现重复远程缺血后适应组的心脏内细胞滞留率更高，PCR检测MSC滞留比例［rRIPoC（2.33±0.46）%，RIPoC（1.85±0.50）%，IR（1.42±0.27）%，F=8.189，P=0.000］；特异CXCR4抗体阻断降低重复远程缺血后适应诱导的心脏内高细胞滞留率［rRIPoC（2.33±0.46）%，CXCR4-Ab（1.82±0.36）%，n=10，P=0.014］和心脏收缩功能改善［rRIPoC（25.90±4.33）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，P=0.003］。结论 重复远程缺血后适应较单次远程缺血后适应提高经心肌注射移植的骨髓MSC在心脏中的移植存留率。CXCR4受体在重复远程缺血后适应后期诱导的心肌高移植存留率中发挥重要作用。

骨髓； 间质干细胞移植； 心肌梗死； 心肌缺血

经心肌注射途径移植细胞是临床上最直接有效的移植方法。但细胞注射到心肌后细胞可能进入血液循环再分布，滞留在心肌的比例大大降低［1］。研究发现细胞移植（cell transplantation，CTx）的数量多少明显影响其疗效［2］。如何提高细胞在缺血心肌区域的数量和存活比例一直是CTx实验的研究热点。有研究显示缺血后适应可以通过旁分泌作用改善缺血组织的微环境提高经心肌注射的移植效率［3］。笔者之前的研究显示在心梗模型中缺血后适应可以提高经静脉路径注射的骨髓间充质细胞募集到缺血心肌［2］。本研究探讨重复远程缺血后适应是否可以在急性心肌缺血大鼠模型中较单次缺血后适应提高经心肌途径移植骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的移植效率及治疗作用。

材料与方法

一、材料

1.实验动物:本实验所使用的动物为SPF级SD大鼠，雄性体重约为60g（约为3周龄），用于分离培养骨髓MSC；雌性体重为250～300g（约为8周龄），用于动物实验。所有操作均按照英国动物1986条例和美国国立卫生局出版的指南相关规定执行。

2.主要试剂及器材:低糖DMEM培养液，胎牛血清和磷酸盐缓冲液由美国GIBCO公司提供；5-溴脱氧尿嘧啶核苷和小鼠来源单克隆抗Brdu抗体由美国Sigma-Aldrich公司提供；细胞计数仪由美国invitrogen公司提供，小动物呼吸机由哈佛生物科技公司提供，倒置荧光显微镜由日本Nikon公司提供，实时荧光定量PCR仪由美国ABI公司提供。

二、方法

（一）MSC的分离

外科手术分离双侧胫股骨冲洗骨髓腔贴壁培养法。通过颈椎脱臼法处死大鼠后，置入盛有75%酒精容器中消毒3～5min，剪开整个后肢皮肤，剥下全层皮肤。使用眼科剪将股骨周围肌肉尽量剔除并修剪关节囊。游离完毕的胫骨和股骨放入盛有培养液的培养皿中。使用5ml注射器抽吸培养基，从关节头端刺入，将关节腔内的骨髓反复多次冲洗至培养皿中，直至关节腔颜色变白，使用电动吸引器连接10ml的吸管将含骨髓细胞的培养基均匀转移至培养瓶。

（二）动物模型

1.实验心肌缺血模型制作［2］:所有实验均采用10%水合氯醛（3.0～3.5ml/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠，行气管插管。调节好小动物呼吸机的参数（60次/min，吸气/呼气=1∶1～1.5，潮气量=10ml/kg）。连接呼吸机，观察胸廓起伏情况；左胸第四肋间区域（乳头下方）横切口，长1cm，钝性分离肋骨外肌肉层；贴第四肋骨上缘（第四肋间隙）前外侧开胸，胸骨撑开器分开上下肋间隙；使用显微镊撕开心包膜，并分向两侧；以6-0prolene线于左心耳与肺动脉流出道交汇处以远2mm处作横向缝扎；缝扎的中点位于左心耳与肺动脉流出道交汇处与心尖连线，进针方向与连线垂直，进针深度为1.5mm。如心脏跳动减弱或心尖区域颜色变白可大致证实心肌缺血模型制作成功，不明显者再次缝扎。如有心律失常发生，给予低浓度利多卡因纱布敷盖左室或心脏按摩。若缺血30min后无左心扩大变白或运动不协调，则认为心肌缺血模型制作不合格。

2.远程缺血后适应模型制作:所有心肌缺血大鼠随机分为四组。远程缺血后适应组（remote ischemic postconditioning，RIPoC）即在大鼠左下肢根部使用血管加压带，加压阻断股动脉血流。阻断5min后释放加压带5min；交替进行4个周期。重复远程缺血后适应组（repeated RIPoC，rRIPoC）即每3d重复施行一次RIPoC。对照组（ischemia reperfusion，IR）直接进行细胞移植。为了验证SDF-1α/CXCR4轴在rRIPoC参与经心肌途径移植细胞中的作用，兔抗大鼠CXCR4多抗（10μg/kg，英国Abcam公司）在首次RIPoC结束后注射至大鼠腹腔内，列为CXCR4-Ab组。

（三）细胞标记与细胞移植

细胞标记使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu，美国Sigma-Aldrich公司）。培养的骨髓MSC在终浓度为10μmol/L的BrdU中37℃孵育1h即可以与DNA结合。使用细胞计数仪确定注射细胞的浓度。MSC收集重悬（4×107/ml，PBS悬浮），抽吸前摇匀数次，每只注射器吸取100μl悬液。将注射器成角30度在心肌梗死边缘三点均匀缓慢注射。

（四）细胞移植定性计数

小鼠来源单克隆抗Brdu抗体（B531，美国Sigma-Aldrich公司）。利用抗Brdu单克隆抗体进行免疫组化染色，定性半定量评价移植细胞数量。

（五）细胞移植定量计数

心功能测定后，静脉注射氯化钾，处死大鼠取出心脏。组织匀浆后提取DNA，PCR计数SRY基因拷贝数。SRY引物序列为F:CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA；R:ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC；一定量的DNA进行10倍梯度的稀释，行PCR实验完成标准曲线的制作。首先根据梯度细胞计算出标准曲线，再以标准曲线所得公式，算出各样本中Ct值对应的细胞数，结合DNA使用量、组织匀浆体积、组织重量计算各样本心脏总的存留数量。

（六）左心功能检测

经胸ECG检测左室心功能细胞移植后1个月进行（n=10）。影像通过12MHz频率测量转换器（飞利浦SONOS5500，北京飞利浦公司）获取。通过二维超声获取胸骨旁长轴和短轴面乳头肌水平影像。测量结果为3个连续心动周期的平均值。其中左室收缩末期直径（LVESD）和左室舒张末期直径（LVEDD）直接测出。左室短轴缩短分数（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100。

三、统计学分析方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，正态分布的计量资料以±s表示，细胞存留比例和心功能参数多组比较采用单因素方差分析，组间差异采用两样本t检验，所有检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、实验模型

在模型制作方面术者已有前期工作基础［2］，手术方式较固定，大鼠心肌缺血模型的制作成功率约在80%，主要的死亡原因是由于解剖变异因素结扎冠脉分支过多或者主干较近导致心梗面积太大，呼吸系统包括气道因素，术后气胸形成等原因。共计60只心肌缺血制作合格的大鼠按照随机数字表划分为4组，因测定Y染色体拷贝数计数细胞存留率，故采取雄性大鼠来源的骨髓间充质干细胞移植到雌性大鼠的异性移植模型。远程缺血后处理的制作无肢体缺血坏死或死亡发生。

二、MSC染色后计数结果

如图1所示，根据台盼蓝染色结果，图示染成蓝色细胞代表死细胞或细胞碎片，平均尺寸为10μm，无染色的细胞代表存活细胞，平均直径为17.2μm，存活比例96%以上。

图1 移植前已染色的MSC存活情况（台盼蓝染色×100）

三、免疫组化检测结果

细胞移植各组均能检测到抗BrdU阳性染为棕黑色的细胞核，而心肌细胞核染为蓝色；几乎所有的BrdU阳性细胞（对应为移植细胞）均分布在梗死心肌边缘区（n=5）。从四组心脏组织免疫组化染色结果可以看出rRIPoC诱导后细胞移植组阳性细胞明显多于RIPoC治疗组和IR组（图2，棕黑色细胞代表移植细胞）。每高倍镜视野下BrdU阳性细胞个数［rRIPoC组（10.6±3.4），RIPoC组（6.6±2.4），IR组（2.6±1.1），CXCR4-Ab组（5.8±1.9），n=5，F=9.798，P=0.001）。

四、移植细胞各组心脏存留率

根据标准曲线及各组的扩增Ct值结果，换算出各组的细胞存留比例［rRIPoC组（2.33±0.46）%，RIPoC组（1.85±0.50）%，IR组（1.42±0.27）%，CXCR4-Ab组（1.82±0.36）%，n=10，F=8.189，P=0.000）］。相对于IR组，RIPoC增加MSC移植后在心肌存留比例130.3%（P＜0.05）；rRIPoC增加MSC移植后在心肌存留比例164.1%（P＜0.05）。CXCR4特异的阻断抗体降低rRIPoC的移植效率，且与RIPoC组结果类似（P＞0.05，表1）。

表1 4组大鼠术后1个月心肌组织中移植的MSC定量情况

五、细胞移植治疗后的各组心功能

rRIPoC处理的细胞移植组的LVFS明显提高［rRIPoC（25.90±4.33）%，IPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，n=10，F=11.422，P=0.000］，LVESD显著性降低［rRIPoC（5.24±0.51）mm，IPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，n=10，F=8.159，P=0.000］，而LVEDD仅较IR组缩小［rRIPoC（7.06±0.40）mm，IR（7.37±0.35）mm，P=0.046］（表2）。

表2 4组大鼠细胞移植术后1个月心功能变化（n=10，± s）

表2 4组大鼠细胞移植术后1个月心功能变化（n=10，± s）

注:与rRIPoC组比较，aP＜0.05；IR组比较，bP＜0.05

组别　LVEDD（mm）　LVESD（mm）　LVFS（%）rRIPoC 　7.07 ± 0.40　5.24 ± 0.51　25.90 ± 4.33 RIPoC　7.25 ± 0.29　5.77 ± 0.44ab　20.60 ± 3.50abIR　7.37 ± 0.35a　6.14 ± 0.33a　16.00 ± 3.20aCXCR4-Ab　7.22 ± 0.27　5.78 ± 0.33a　20.00 ± 3.23abF 值　1.457　8.159　11.422 P 值　0.243　0.000　 0.000

图2 倒置相差显微镜下观察术后1个月心肌组织中移植的MSC免疫组化染色情况（×100）

讨 论

本实验表明在大鼠急性心肌缺血模型中，rRIPoC提高经心肌注射途径CTx的移植效率和治疗心肌缺血的疗效。相对于RIPoC通过改善心肌缺血后微环境提高心内细胞存留比例，rRIPoC后期主要作用是通过募集经心肌注射后体内再分布的细胞所致。

干细胞移植治疗心肌梗死是一个备受关注的研究领域［4］。多数研究表明CTx治疗心梗具有一定的疗效。目前干细胞治疗已进入三期临床实验，表明其逐渐演化为一种生物制剂［5］。但是一直以来都面临心内细胞难以驻留、存留比例极低这个共同难题［6］。尽管细胞在体内的具体作用机制仍未明确，但是基本上不支持MSC向心肌细胞转化，多认为与细胞移植后在心肌产生分泌作用有关［7］。因此理论上更多的细胞停留在心脏可以提高治疗效率。研究显示经心肌注射骨髓供体细胞在心脏中的比例由最初的34%～80%降低到6周时的0.3%～3.5%。早期细胞死亡及后期细胞再分布至其他脏器是心脏存留比例下降的主要原因［1］。

RIPoC可以减轻心肌缺血再灌注损伤，提供经心肌注射移植细胞“友好的”微环境［8］。细胞移植到RIPoC作用后的心肌理论上可以增加细胞的幸存［3］。再灌注时线粒体通透性转化孔开放，及时RIPoC能够延迟线粒体通透性转化孔开放，减轻心肌缺血再灌注损伤发生［9］。在体大鼠实验将首次再阻断的时间从再灌注后10s推移到60min，缺血后适应减少心梗面积的效应就会丢失［10］。因此，理论上为期1个月的rRIPoC后期不能像早期产生突出的心脏保护作用，也就不能为移植细胞提供“友好的”微环境。

在大鼠心梗模型中研究采取了缺血期间施行缺血适应后每3d或每天施行缺血后适应三组对比研究心室重构和生存率。该研究发现首次RIPoC后rRIPoC相比单次缺血期间适应方案效果可以数量-效应方式减轻心室重构并增加生存率［11］。而且首次RIPoC后每天rRIPoC其作用效果最强。但综合考虑到实验效应以及简化实验方案，故本研究采取每3d的rRIPoC的实验方案。

既往研究发现缺血预适应后期通过募集骨髓干细胞保护缺血再灌注的损伤［12］。既往研究发现RIPoC这种无创、简单、可反复利用的心肌保护技术改善经静脉途径CTx的效率［2］。该实验发现RIPoC可以诱导亚急性梗死心肌-血液间SDF-1梯度产生，联合CTx治疗亚急性心梗后可以改善心功能。而通过特异性阻断骨髓MSC上SDF-1α对应的CXCR4抗体，降低了静脉注射细胞在心脏中存留率。其原理是RIPoC可以通过提高心肌组织的SDF-1浓度募集经静脉途径移植的带有CXCR4骨髓MSC到缺血心肌组织。

理论上rRIPoC早期改善经心肌注射移植的移植环境和后期募集再分布至其他器官的细胞回到心肌。rRIPoC辅助CTx有两个不同的作用:第一，早期RIPoC可以减轻缺血心肌的再灌注损伤，为细胞移植提供更“友好的”微环境；第二，后期重复RIPoC最早在第3天，已远远超过心肌保护的最大时间（60min）［10］，故对线粒体通透性转化孔开放影响甚小。但在急性心梗期后可诱导心肌-血液中SDF-1的浓度梯度形成，募集早期心肌注射后再分布到其他器官或者血液循环中的移植细胞进入心脏。

为了验证CXCR4受体在rRIPoC参与经心肌途径移植细胞中的作用，采用CXCR4特异性抗体注射至大鼠腹腔内，通过抗体阻断间充质细胞表面上CXCR4受体，从而阻断CXCR4受体在细胞募集中的作用，因而仅保有单次RIPoC改善心肌微环境的效能。

本实验研究发现rRIPoC提高经心肌注射途径CTx的心内存留率具有明显的转化医学意义。首先，早期RIPoC是一种内源性心肌缺血保护策略，肢体实行RIPoC安全无创；本实验中实行RIPoC无肢体缺血坏死情况。其次，RIPoC可以广泛反复施行且不受时间限制。临床应用中，通过加压止血带在肢体上加压和放气实行RIPoC。最后，后期多次重复RIPoC产生有利于移植细胞募集到缺血心肌的作用信号。

rRIPoC较单次RIPoC［13］能够提高经心肌注射途径CTx的心内细胞存留率，并且改善CTx治疗后缺血心脏的心功能。CXCR4受体在rRIPoC后期提高MSC经心肌注射移植的心脏内细胞存留率的过程中发挥重要作用。相比于使用细胞预处理方式提高细胞在心肌的存活率［14］，rRIPoC是提高经心肌注射途径CTx治疗心梗的一项简便、安全、有效的策略。

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（本文编辑:蔡晓珍）

Effects of repeated remote ischemic postconditioning on bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in acute ischemic myocardium

Jiang Qin， Xiang Bo， Yu Tao， Huang Keli. Department of Cardiac Surgery， Sichuan Provincial People's Hospital， Chengdu 610072，China
Corresponding author: Huang Keli， Email:kelihuang028@hotmail.com

Objective To investigate the effect of repeated remote ischemic postconditioning（rRIPoC）on the retention of mesenchymal stem cells in the acute rat myocardial ischemia model. Methods Myocardial ischemia of adult female SD rats was induced by ligation of the left anterior descending（LAD）coronary artery for 30 minutes. Male SD rat-derived mesenchymal stem cell（MSC）were harvested from bone marrow. Cells of the third passage were used. A total of 4 × 106MSC were intramyocardially infused into 60 femaleMI rats which were randomly assigned into IR， RIPoC， rRIPoC， and CXCR4-Ab groups. RIPoC group was induced with 4 cycles of 5-minute occlusion and reperfusion of the limb. rRIPoC group was induced with 4 cycles of 5-minute occlusion and reperfusion of the limb every three days. For CXCR4-Ab group， anti-CXCR4 antibody was intraperitoneally administered before rRIPoC procedure. One month later， all groups underwent left ventricular function examination. MSC engraftment in the myocardium was evaluated by immunohistochemistry （IHC）examination and quantitative polymerase chain reaction（PCR）for SRY gene in Y chromosome.Statistical analysis was conducted with two-way ANOVA and t test. Results MSC significantly ameliorated left ventricular shortening fraction ［rRIPoC （25.90±4.33）%，RIPoC（20.60±3.50）%，IR（16.60±3.20）%，CXCR4-Ab（20.00±3.23）%，F=11.422，P=0.000］ and left ventricular end-systolic diameter［rRIPoC（5.24±0.51）mm，RIPoC（5.77±0.44）mm，IR（6.15±0.33）mm，CXCR4-Ab（5.78±0.33）mm，F=8.159，P=0.000］.IHC examination for labeled infused cells and PCR analysis for Y chromosome demonstrated that rRIPoC significantly increased MSCs retention in myocardium［rRIPoC（2.33±0.46）%， RIPoC（1.85±0.50）%， IR（1.42±0.27）%， F = 8.189， P = 0.000］.Furthermore， blockade with anti-CXCR4 antibody before rRIPoC markedly decreased therapeutic efficacy［rRIPoC（2.33±0.46）%， CXCR4-Ab（1.82±0.36）%，n=10，P=0.014］and LVFS［rRIPoC（25.90±4.33）%， CXCR4-Ab（20.00±3.23）%， P = 0.003］. Conclusions rRIPoC enhanced the retention of the intramyocardially infused MSCs in the ischemic myocardium compared with RIPoC. CXCR4 receptor played a pivotal role in rRIPoC-induced MSC retention.

Bone marrow； Mesenchymal stem cell transplantation； Myocardial infarction； Myocardial ischemia

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.003

四川省人民医院博士基金（30305030842）

610072 成都，四川省人民医院心脏外科中心

黄克力，Email:kelihuang028@hotmail.com

2015-08-03）