RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

许赤蔡惠宁李翠平陈文捷



RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

许赤1蔡惠宁2李翠平2陈文捷2

目的 采用RNA干扰手段抑制营养缺乏自噬因子1（NAF1）在肝细胞癌MHCC-97H细胞中的表达，观察其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。方法 采用NAF1-siRNA和空白对照NC-siRNA转染肝细胞癌MHCC-97H细胞，设为NAF组和NC组，同时设立未转染空白对照组（Blank组）。荧光实时定量PCR法检测MHCC-97H细胞NAF1 mRNA表达。Western blotting法检测MHCC-97H细胞NAF蛋白和基质金属蛋白酶9（MMP9）蛋白表达。细胞划痕实验检测MHCC-97H细胞迁移能力。Transwell实验检测MHCC-97H细胞侵袭能力。荧光素酶报告基因实验检测MHCC-97H细胞核因子κB（NF-κB）信号通路的相对活性。多组间数据的比较用单因素方差分析，两组之间数据的比较采用t检验。结果 NAF组MHCC-97H细胞NAF1-mRNA的相对表达量为（6.50±0.23）%，低于Blank组的（100.80±0.60）%，且差异具有统计学意义（t=14.17P=0.02）。NAF组MHCC-97H细胞NAF1蛋白和MMP9蛋白的相对表达量分别为0.12±0.01、0.07±0.01，均低于Blank组的0.79±0.05、0.81±0.02，且差异均有统计学意义（t=5.21、7.45，P=0.00、0.02）。NAF组MHCC-97H细胞的迁移距离明显小于Blank组。NAF组穿膜细胞的数量为（11.28±1.56）个/视野，少于Blank组的（197.87±3.18）个/视野，且差异有统计学意义（t=7.97，P=0.00），NAF组NF-κB信号通路的相对活性值3.25±0.53明显低于Blank组的26.69±7.41，差异具有统计学意义（t=13.33，P=0.01）。结论 采用RNA干扰手段抑制NAF1的表达可能成为抑制肝细胞癌侵袭转移的有效手段。

癌，肝细胞； RNA干扰； 细胞增殖； 肿瘤侵润

肝细胞癌的发病率占肝脏肿瘤总发病率的90%左右，严重影响患者健康。目前对肝细胞癌主要的治疗手段为根治性切除术，但由于多数肝癌病灶在发现时已发生侵袭、转移，影响手术治疗的总体疗效［1-3］。因此，亟待开发包括靶向化基因治疗在内的新型治疗手段以抑制肝癌细胞的侵袭、转移，改善患者生存［4-6］。营养缺乏自噬因子1（nutrient-deprivation autophagy factor-1，NAF1）蛋白在多种恶性肿瘤中异常高表达，近年有研究发现在肿瘤细胞中对影响其表达水平可以实现对恶性肿瘤的抑制作用［7］。然而，针对NAF1的靶向化基因治疗手段在肝细胞癌中的作用尚不明确。本研究尝试采用RNA干扰手段抑制NAF1在肝细胞癌MHCC-97H细胞中的表达，观察该治疗手段对肝癌细胞侵袭转移能力的抑制作用，并初步明确其起效机制。

材料与方法

一、材料

1.细胞株:肝细胞癌MHCC-97H细胞株由中山大学附属第三医院疫苗研究所实验室冻存。

2.主要试剂和仪器:NAF1小干扰RNA（NAF1-siRNA）、阴性对照siRNA（NC-siRNA）和RT-PCR所用引物由广州亚科生物科技有限公司合成。DMEM高糖培养基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰酶、磷酸缓冲盐溶液（PBS）购自美国Gibco公司。实时逆转录试剂盒购自日本Takara公司。Lipofectamine®3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。兔抗人NAF1、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）、GAPDH抗体购自美国Invitrogen公司。报告基因质粒（pKF-κB-luc）、内参质粒（pRL-SV40）和Dual-luciferaseTMReport试剂盒购自广州亚科生物技术有限公司。LightCycler®2.0实时荧光定量PCR系统购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。Luminometer LB-9507超灵敏管式发光仪（荧光素酶检测仪）购自德国Berthold公司。

二、方法

1.细胞转染及分组:复苏培养MHCC-97H肝细胞癌细胞株。以10%FBS的DMEM高糖培养基作为培养基，常规培养。细胞融合度达60%时，采用转染试剂Lipofectamine®3000和NAF1-siRNA、NC-siRNA，按照试剂说明书转染培养2d后设为NAF组和NC组进行实验。同时设立未转染空白对照（Blank）组。

2.荧光实时定量PCR检测MHCC-97H细胞NAF1 mRNA表达:分别按照常规方法提取3组MHCC-97H细胞总RNA，逆转录合成cDNA。以GAPDH作为内参进行RT-PCR检测。PCR反应条件:92℃预变性6 min，91℃变性28s，51℃退火32s，69℃荧光检测8s，53个循环后，69℃延伸5min。测得的数据后计算RNA的相对表达量。每组实验重复3次。（表1）

3.Western blotting法检测MHCC-97H细胞蛋白表达:分别提取3组转染后MHCC-97H细胞总蛋白。进行蛋白定量后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白。聚偏二氟乙烯膜电转移后，蛋白封闭1h。加入NAF1、MMP9和GAPDH抗体。恒温过夜后洗涤，加辣根过氧化物酶标记的兔抗人二抗。增强化学发光显色，胶片曝光检查蛋白表达水平，以GAPDH作为内参照。每组实验重复3次。

表1 PCR实验所需的引物名称及序列

4.细胞划痕实验检测MHCC-97H细胞迁移能力:分别取转染后的MHCC-97H细胞接种于6孔板进行培养。培养至细胞80%融合度时用移液器枪头分别在每孔划一直线。用PBS轻柔冲洗孔板中细胞3次，去除漂浮细胞。加入DMEM高糖培养基继续培养12h后拍照，观察细胞迁移距离代表细胞的迁移能力。

5.Transwell实验检测MHCC-97H细胞侵袭能力:在每个Transwell小室上室底部加入50μl稀释后的液态Matrigel胶。细胞培养箱中静置使其凝固。将转染后的MHCC-97H细胞接种入Transwell小室上室后，在下室中加入480μl含有血清的完全培养基。培养条件同前，培养1d后去除上室底部未过膜的细胞，用多聚甲醛固定后结晶紫染色过膜细胞，显微镜下观察穿过膜的细胞数量代表细胞的侵袭能力。

6.荧光素酶（Luciferase）报告基因实验检测MHCC-97H细胞核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路的相对活性:严格按照荧光素酶检测试剂盒要求，分别取转染后的MHCC-97H细胞接种于24孔板，PBS冲洗后处理细胞。每孔加入150μl细胞裂解液裂解0.5h。收集细胞裂解液，由荧光素酶检测仪双针孔自动加入荧光素酶检测试剂后对荧光定量结果进行检测。

三、统计学分析方法

采用SPSS16.0软件进行分析。mRNA表达水平、功能蛋白表达水平和NF-κB信号通路的相对活性值数据用±s表示，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两组之间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、NAF1-siRNA对MHCC-97H细胞NAF1-mRNA表达的影响

通过RT-PCR实验测得NAF组NAF1-mRNA的相对表达量为（6.50±0.23）%，与作为对照的Blank组（100.80±0.60）%相比，差异具有统计学意义（t=14.17，P=0.02）。而NC组NAF1-mRNA相对于Blank组的相对表达量为（97.83±1.82）%，与Blank组相比，差异无统计学意义（t=0.29，P=0.60）。

二、NAF1-siRNA对MHCC-97H细胞功能蛋白表达的影响

如图1所示，NAF组MHCC-97H细胞的NAF1蛋白和MMP9蛋白的相对表达量分别为0.12±0.01、0.07±0.01，而NAF1蛋白和MMP9蛋白在Blank组的相对表达量分别为0.79±0.05、0.81±0.02，差异具有统计学意义（t=5.21，7.45；P=0.00，0.02）。NAF1蛋白和MMP9蛋白在NC组细胞中的相对表达量分别为0.75±0.11、0.79±0.04，与Blank组MHCC-97H细胞对应蛋白的表达量相比差异无统计学意义（t=1.25，2.57；P=0.45，0.18，表2）。

图1 MHCC-97H细胞NAF1和MMP9蛋白表达水平的比较

表2 3组MHCC-97H细胞NAF1-mRNA、NAF1蛋白、MMP9蛋白表达水平（± s）

表2 3组MHCC-97H细胞NAF1-mRNA、NAF1蛋白、MMP9蛋白表达水平（± s）

分组　NAF1-mRNA（%）　NAF1蛋白　MMP9蛋白NAF组　 6.50 ± 0.23　0.12 ± 0.01　0.07 ± 0.01 NC组　 97.83 ±1.82　0.75±0.11　0.79 ± 0.04 Blank组　100.80 ± 0.60　0.79 ± 0.05　0.81 ± 0.02 F 值　13.05　16.85　13.46 P 值　 0.01　 0.00　 0.01

三、NAF1-siRNA对MHCC-97H细胞迁移能力的影响

图2 光学显微镜下观察MHCC-97H细胞迁移距离的比较（×5）

如图2所示，划痕12h后，NAF组MHCC-97H细胞的迁移距离小于Blank组，迁移能力受到明显抑制。而NC组MHCC-97H细胞在划痕12 h后的迁移距离与Blank组差异无统计学意义。

四、NAF1-siRNA对MHCC-97H细胞侵袭能力的影响

如图3所示，24h培养后，NAF组穿膜细胞的数量（11.28±1.56）个/视野明显少于Blank组的（197.87±3.18）个/视野，差异具有统计学意义（t=7.97，P=0.00），侵袭能力受到明显抑制。而NC组穿膜细胞的数量（203.08±10.96）个/视野与Blank组的差别没有统计学意义（t=0.15，P=0.34）。

图3 光学显微镜下观察MHCC-97H细胞穿膜数量的比较（结晶紫染色×5）

五、NAF1-siRNA对MHCC-97H细胞NF-κB信号通路活性的影响

荧光素酶报告基因实验的结果显示，NAF组MHCC-97H细胞NF-κB信号通路的相对活性值3.25±0.53，明显低于Blank组的26.69±7.41，差异具有统计学意义（t=13.33，P=0.01）。而NC 组NF-κB信号通路的相对活性值27.31±1.66与Blank组比较差异无统计学意义（t=0.83，P=0.39）。

讨 论

NAF1是一种新发现的与细胞生存和寿命密切相关的蛋白，定位于4号染色体的长臂［8］。该蛋白除参与细胞的能量代谢相关外，还与乳腺癌、舌癌等多种恶性肿瘤的发生、发展具有密切关系［7，9］。目前的研究认为，其在恶性肿瘤中可能通过NF-κB、JAK-STAT和PI3Ks等信号通路影响一系列与肿瘤细胞恶性程度相关的功能蛋白，进而影响肿瘤细胞的生物学行为［10-11］。所以，有望通过适当的手段对NAF1进行靶向化干预，实现对恶性肿瘤的抑制［12-13］。本研究采用的NAF1-siRNA作用于肝癌细胞后，使NAF1-mRNA的相对表达量降低为对照组的6.50%左右，蛋白表达水平也发生了明显的降低，说明本研究采用的NAF1-siRNA在转染后可以实现了对NAF1蛋白表达的有效抑制，降低了NAF1蛋白在肝癌细胞中的水平。在进一步的研究中，通过细胞划痕实验和Transwell实验发现，NAF1表达受到抑制的MHCC-97H肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力发生了明显降低，说明NAF1-siRNA的靶向治疗手段可以实现对肝癌细胞侵袭、转移功能的抑制。

为了明确NAF1-siRNA抑制肝癌细胞侵袭、转移功能的分子机制，本研究进一步检测了与细胞侵袭、转移功能相关的功能蛋白的表达水平，发现伴随NAF1蛋白表达的抑制，MMP9蛋白的表达水平也发生了明显的降低。所以笔者推测，NAF1蛋白表达量与MMP9蛋白的表达水平可能具有一定的正相关关系。MMP9蛋白是基质金属蛋白酶的一种，以酶原的形式从胞内生成后分泌到细胞外，其在肿瘤中的主要功能是降解细胞外基质，为肿瘤细胞的侵袭和转移创造条件。目前普遍认为，对MMP9的表达水平进行抑制，肝癌细胞的迁移和侵袭能力就会受到明显抑制［14-15］。同时，本研究希望通过对细胞信号通路的进一步探讨明确NAF1表达水平与MMP9蛋白之间这种可能的表达水平协同变化的机制。在本研究中通过对NF-κB信号通路转录活性的考察发现，NAF1-siRNA干预后的肝癌细胞，该信号通路的活性明显降低。这种NF-κB信号通路活性的降低可能与NAF1-siRNA引发的NAF-1蛋白表达量降低相关，但是尚需大量进一步的研究加以确证。大量研究表明，NF-κB信号通路与MMP9的表达水平及多种肿瘤细胞的侵袭转移密切相关［16-18］。MHCC-97H是典型的高转移性肝癌细胞株。本研究发现的实验现象说明在MHC-97H细胞中，NAF1-siRNA可以通过抑制NAF1蛋白的表达降低了NF-κB信号通路的转录活性，进而降低了MMP9蛋白的生成，产生了对肝癌细胞侵袭、转移的抑制效果。

综上所述，NAF1蛋白可能与肝细胞癌的侵袭、转移密切相关，其作用机制可能与NF-κB信号通路和MMP9蛋白相关。采用基因治疗手段靶向化抑制NAF1的表达可能成为实现抑制肝癌细胞侵袭、转移，改善肝癌总体治疗效果的有效手段。

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（本文编辑:陈媛媛）

Effect of down-regulation of nutrient-deprivation autophagy factor-1 expression by RNA interference on the invasion and metastasis of hepatocellular cancer cells

Xu Chi1， Cai Huining2， Li Cuiping2， Chen Wenjie2. 1Department of Hepatic Surgery， 2Biotherapy Center， the Third Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510630， China
Corresponding author: Chen Wenjie， Email: chenwenjie168@126.com

Objective RNA interference was used to inhibit the expression of nutrientdeprivation autophagy factor-1（NAF1） in MHCC-97H hepatocellular carcinoma （HCC）cells，and its effect on the invasion and metastasis of HCC cells was observed. Methods MHCC-97H cells were transfected with NAF1-siRNA and blank control NC-siRNA. To detect the expression of NAF1 mRNA in MHCC-97H cells， real time fluorescence quantitative PCR was used. Expression of NAF1 protein and MMP9 protein of MHCC-97H cells were detected by western blotting assay. MHCC-97H cell migration and invasion ability was evaluated using cell scratch assay and transwell assay respectively. Luciferase reporter gene assay was used to evaluated the activity of nuclear factor κB（NF-κB） signaling pathway. Data among multiplegroups were compared with one-way ANOVA， and data between two groups with LSD-t test. Results The relative expression of NAF1-mRNA in NAF group was（6.50±0.23）%， as compared with blank control group（100.80 ± 0.60）%（t=14.17，P=0.02）. The relative expression of NAF1 protein and MMP9 protein of MHCC-97H cells， which were 0.12±0.01 and 0.07±0.01 respectively in the NAF group， were lower than those of the blank group （0.79±0.05 and 0.81±0.02； t=5.21 and 7.45； P=0.00 and 0.02，respectively）. Cell migration in the NAF group was significantly inhibited as compared with the blank group. The number of penetrating cells in the NAF group （11.28±1.56）/ visual field was significantly less than that in the blank group（197.87±3.18）/ visual field，（t=7.97，P =0.00）. The relative activity value of NF-κB signaling pathway of the NAF group was 3.25±0.53， significantly lower than that of the blank group（26.69±7.41， t=13.33，P=0.01）. Conclusion RNA interference to inhibit the expression of NAF1 may be an effective means of suppressing liver cancer cell invasion and metastasis.

Carcinoma，hepatocellular； RNA interference； Cell proliferation； Neoplasm invasiveness

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.002

国家自然科学基金（81301331，81302550）；教育部高等学校博士点专项科研基金新教师类资助课题（20110171120091）；广东省科技计划项目（2011B080701063）

510080广州中山大学附属第三医院肝脏外科1，生物治疗中心2

陈文捷，Email:chenwenjie168@126.com

2015-12-18）