基于响应面法的闪式提取桦褐孔菌多糖工艺优化

荣芳悦，张 宇，赵 宏，王宇亮，秦永丽，丛晶男（黑龙江省高校生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007）

基于响应面法的闪式提取桦褐孔菌多糖工艺优化

荣芳悦，张 宇*，赵 宏，王宇亮，秦永丽，丛晶男
（黑龙江省高校生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007）

利用响应面法优化桦褐孔菌多糖的闪式提取工艺。在单因素实验的基础上，以桦褐孔菌多糖的提取率为响应值，以料液比、提取时间、提取电压为主要考察因素，采用响应面法优化闪式提取桦褐孔菌多糖的最佳工艺参数。结果表明，经响应面优化得到料液比为1∶23，提取时间为86 s，提取电压为150 V时，桦褐孔菌多糖的提取率最高，可达到8.52%。结论：闪式提取法适用于桦褐孔菌多糖的提取，该工艺具有方便、快速和高效的优点。且经响应面法优化所得的最佳提取条件准确可靠，具有一定的实用价值。

桦褐孔菌，多糖，闪式提取，响应面法

桦褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是一种食药两用型的真菌［1］，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，其主要分布在北纬45°～50°［2］，如北美、芬兰、波兰、俄罗斯、中国的黑龙江和吉林、日本等国家和地区［3］。桦褐孔菌是白桦树、银桦、赤杨等的树干或树皮下形成的不育的木腐菌［4］，外表呈黑灰色，有不规则的沟痕及深裂，质硬且脆［5］。从16世纪开始，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就开始食用桦褐孔菌，用于防治多种疾病［6］。桦褐孔菌在俄罗斯以及东欧等地被当作一种民间用药，已被用于消化系统疾病，胃癌、结肠癌和肝癌，心血管疾病，糖尿病和病毒性疾病的治疗［7］。据报道，桦褐孔菌中含有多种具有生物活性的有效成分，如多糖、三萜类化合物、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素、木脂素、黑色素等［8-10］，而其中，桦褐孔菌多糖作为桦褐孔菌重要的活性成分之一，因其具有免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤及降血糖［11-13］等多种生物活性而备受关注。

目前，真菌多糖的提取方法主要有热水浸提法、酸提法、碱提法、酶提法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法［14］。其中，桦褐孔菌多糖的提取多采用传统的热水浸提法。近年来，闪式提取法已被广泛应用于植物以及微生物多糖的提取，如沙棘多糖［15］、香菇多糖［16］等。闪式提取法是依靠高速机械剪切力和超

动分子渗滤技术，在室温及溶剂存在下数秒钟内把物料破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，以达到提取之目的。且闪式提取法具有快速、高效，操作简便、节能等优点［17-18］。

因此，本文采用闪式提取法提取桦褐孔菌多糖，并用响应面分析法对闪式提取工艺进行优化，以期为桦褐孔菌多糖的提取寻找更加快速高效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌子实体 黑龙江省高校生物药制剂重点实验室提供；乙醇 分析纯，山东利尔康消毒科技股份有限公司；双蒸水 实验室自制。

FDU-1200型冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司；KQ-5200型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FA2004N型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；DL-5-B低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-2电热恒温水浴锅 苏州威尔实验用品有限公司；JHBE-50S闪式提取器 北京金鼎科技发展有限公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；XFB-400小型中药粉碎机 吉首市中诚制药机械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 桦褐孔菌多糖的提取 桦褐孔菌子实体经过机械粉碎后，用体积分数为88%的乙醇溶液在80℃条件下超声2 h，离心（5000 r/min，15 min）后去除上清液，沉淀在60℃干燥12 h，得到脱脂的桦褐孔菌粉。取脱脂处理的桦褐孔菌粉50 g置于闪式提取器的提取罐内，以水作为溶剂，在一定的料液比和一定的提取电压下，用闪式提取器提取一定的时间后，提取液离心（5000 r/min，15 min）去掉沉淀，上清液减压浓缩后加入体积分数为95%的乙醇，使乙醇体积分数达到80%，静置24 h，次日经过离心（5000 r/min，15 min）后收集沉淀，冷冻干燥，即得桦褐孔菌多糖。

1.2.2 单因素实验 选择对多糖提取影响较大的三个因素液料比、提取时间和提取电压，每个因素选取五个水平，分别考察这三个因素对桦褐孔菌多糖提取率的影响。

1.2.2.1 料液比对提取率的影响 称取经过处理的桦褐孔菌粉50 g（5份）置于提取罐中，每份料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取时间80 s、提取电压140 V，按1.2.1项下方法闪式提取多糖，分别计算桦褐孔菌多糖的提取率。

1.2.2.2 提取时间对提取率的影响 称取经过处理的桦褐孔菌粉50 g（5份）置于提取罐中，料液比为1∶20，提取电压140 V，提取时间分别为50、60、70、80、90 s，按1.2.1项下方法闪式提取多糖，分别计算桦褐孔菌多糖的提取率。

1.2.2.3 提取电压对提取率的影响 称取经过处理的桦褐孔菌粉50g（5份）置于提取罐中，料液比为1∶20，提取时间80 s，提取电压分别为120、130、140、150、160 V，按1.2.1项下方法闪式提取多糖，分别计算桦褐孔菌多糖的提取率。

1.2.3 响应面实验设计 根据Box-Behnken模型的中心组合实验设计原理，综合单因素实验，以料液比（A）、提取时间（B）、提取电压（C）三个因素设计响应面分析因素及水平（见表1），对桦褐孔菌多糖的闪式提取工艺条件进行优化。

表1 响应面分析因素及水平Tabie 1 Table of factors and levels of response surface experiments

1.2.4 桦褐孔菌多糖提取率的计算

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件对得到的数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对提取率的影响 闪式提取中，随着原料药逐渐破碎，原料药中被提取的物质分子暴露于溶剂环境中并迅速转移至溶剂中，在提取时间与提取电压一定的条件下，溶剂体积越大，则被提取的物质分子与之接触越充分，提取率就越大，并在所用溶剂达到一定体积时趋于平衡。在本实验中，桦褐孔菌多糖的提取率随料液比的增大而增加，在料液比为1∶15时增加明显，且在料液比为1∶20时提取率最大，随后趋于平缓。因此，为减少后期浓缩时的工作量，选择液料比为1∶20（见图1）。

图1 料液比对提取率的影响（n=5）Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate（n=5）

2.1.2 提取时间对提取率的影响 闪式提取中，在料液比与提取电压一定的条件下，提取时间越长原料药的破碎程度越高，且随着提取时间的延长被提取的物质分子从原料药向溶剂中的转移率越高并逐渐达到平衡。在本实验中，随着提取时间的延长，桦褐孔菌多糖的提取率不断增加，提取率在70 s左右增加较为明显，80 s时达到最大。因此，选择提取时间为80 s（见图2）。

2.1.3 提取电压对提取率的影响 闪式提取中，提取电压越大刀头转速越大，破碎和搅拌作用越强，在料液比与提取时间一定的条件下，提取率随着提取电压的增大而增大并逐渐达到平衡，在提取电机电压为150 V时多糖的提取率最大（见图3）。

图3 提取电压对提取率的影响（n=5）Fig.3 Effect of extraction voltage on the extraction rate（n=5）

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面优化结果 根据Box-Behnken的中心组合实验设计的方案分别进行了17组实验，实验结果见表2。

2.2.2 响应面结果分析

2.2.2.1 方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归模型：Y=+8.27+0.74A+0.64B+0.38C+0.12AB+0.33AC+0.41BC-0.93A2-0.70B2-1.06C2运用软件对模型进行方差分析，考察模型的可靠性，结果见表3。

由表3可知，模型显著性检验p＜0.05，表明该模型具有统计学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本模型失拟项p值为0.1056＞0.05，说明此模型具有可行性。校正决定系数R2为0.9994，说明模型响应值的变化有99.94%来自所选因变量，且该模型只有0.06%的变异，能由该模型解释，进一步说明模型拟合优度较好。其自变量一次项A，B，C，二次项AB，AC，BC，A2，B2，C2均极显著（p＜0.01）。

2.2.2.2 三维响应曲面图分析 作响应值Y与各因素构成的三维空间响应面图，以反映料液比、提取时间、提取电压3个关键因子及其交互作用对桦褐孔菌多糖提取率的影响（见图4～图6）。

表2 响应面实验设计方案和结果Table2 Table of design and results of response surface experiments

表3 回归统计分析结果Table3 Table of results of regression analysis

图4～图6为响应面值Y与A、B、C构成的三维空间响应面图，可更直观的反应各因素间的交互作用对桦褐孔菌多糖提取率的影响。通过观察曲面的倾斜度确定两个因素交互作用对响应值的影响程度，倾斜度越高则说明两者交互作用越显著。因此，由图4可以看出料液比对桦褐孔菌多糖提取率影响较为显著，表现为曲面最陡，依次为提取时间、提取电压，表现为曲面较陡、较平滑。最后经典型性分析可知，桦褐孔菌多糖闪式提取的最佳工艺参数为：料液比1∶22.52，提取时间为86.13 s，提取电压为153.76 V，预测桦褐孔菌多糖的提取率达到8.73%。

图4 料液比和提取时间对桦褐孔菌多糖提取率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rate

图5 料液比和提取电压对桦褐孔菌多糖提取率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio and extraction voltage on the extraction rate

图6 提取时间和提取电压对桦褐孔菌多糖提取率的影响Fig.6 Effect of extraction time and extraction voltage on the extraction rate

验证实验：为确保实验的可行性，将最优提取工艺参数调整为：料液比1∶23，提取时间为86 s，提取电压为150 V，在此条件下闪式提取桦褐孔菌多糖。实验结果表明，此条件下桦褐孔菌多糖提取率为8.52%，与预测值8.73%的相对误差为2.46%。说明该方程模拟效果很好，响应面法优化所得的提取条件参数准确可靠，具有一定的实用价值。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化闪式提取桦褐孔菌多糖的提取工艺，得到最佳提取工艺为料液比1∶23，提取时间为86 s，提取电压为150 V，此条件下桦褐孔菌多糖提取率为8.52%，证明闪式提取法适用于桦褐孔菌多糖的提取，闪式提取法在将桦褐孔菌原料药粉碎的同时，通过浸渍、搅拌作用使多糖分子与溶剂充分接触，最大限度地实现多糖分子从物料向溶剂中的转移，且弥补了传统方法耗时长、有效成分受热易被破坏的缺点，极大地缩短了实验研究的时间与成本，具有一定的应用价值。

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Optimization of homogenate extraction of polysaccharides from Inonotus obliquus based on response surface methodology

RONG Fang-yue，ZHANG Yu*，ZHAO Hong，WANG Yu-liang，QIN Yong-li，CONG Jing-nan
（Key Laboratory of Biological Medicine Preparations，Institute of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）

Used the response surface methodology to optimize the homogenate extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus.To optimize the optimum process parameters of the homogenate extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus using response surface methodology which based on the single factor test that used extraction rate as response value and used solid-liquid ratio，extraction time and extraction voltage as the main study factors.The results indicated that the optimum condition was achieved when solid-liquid ratio was 1∶23，extraction time was 86 s，and extraction voltage was 150 V.The extraction rate was the highest，which could reach 8.52%.Conclusion：The homogenate extraction was suitable for extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus.The process had the advantages of convenient，fast and efficient.The optimal conditions based on response surface methodology were accurate.

Inonotus obliquus；polysaccharide；homogenate extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）08-0286-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.051

2015－09－10

荣芳悦（1991-），女，硕士研究生，研究方向：天然药物活性成分筛选及新药开发，E-mail：975760808@qq.com。

*通讯作者：张宇（1964-），女，教授，研究方向：天然药物活性成分筛选及新药开发，E-mail：zhangyu_1964@163.com。

黑龙江省教育厅项目（12541818）；佳木斯大学科技创新团队基金（CXTD-2013-05）；青年创新人才基金（22Zq201501）。