氨基酸对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的影响

殷海松，范栩嘉，汤卫华，边艳慧，陈 珊，乔长晟，*（1.天津现代职业技术学院生物工程学院，天津0050；.天津轻工业化学研究所有限公司，天津0050；.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津00457）

氨基酸对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的影响

殷海松1，2，范栩嘉3，汤卫华2，边艳慧3，陈 珊2，乔长晟3，*
（1.天津现代职业技术学院生物工程学院，天津300350；2.天津轻工业化学研究所有限公司，天津300350；3.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

本文研究了添加氨基酸对出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337发酵生产聚苹果酸（PMLA）的影响。通过单因素实验和正交实验分别对氨基酸种类及其添加量进行优化。由单因素实验可知：天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）和苏氨酸（Thr）对菌体生长和PMLA合成最有利。由正交实验可知：氨基酸的最优组合为（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、缬氨酸（Val）0.4、苏氨酸（Thr）0.4。在最优组合条件下获得的PMLA产量和分子量分别达到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸获得的PMLA产量和分子量分别提高了40.92%和45.20%。

出芽短梗霉，聚苹果酸，氨基酸

聚苹果酸（PMLA）是一种水溶性脂肪族聚酯类化合物［1-2］，由于主链上含有酯键而被称为聚酯类化合物，在有水的环境中可以自发降解或者发生酶促反应而被降解。聚苹果酸及其衍生物由于具有生物降解性、高度水溶性、生物相容性、可吸收性、可化学衍生性及无免疫原性［3］等优良特性，可以用作药物载体［4］及微胶囊材料、生物医学材料等。PMLA的制备方法主要有化学合成法和生物发酵法2种。化学法合成聚苹果酸分子量较小；生物发酵法合成聚苹果酸优点突出，产物均为β型而且分子量高、产物纯度高［5-6］。

生物合成聚苹果酸（PMLA）的研究最早始于20世纪60年代，Shimada等［7］从环状青霉（Penicillium cyclopium）中分离得到一种能够抑制该菌的蛋白酶活性的高分子聚合物，经研究发现该聚合物为PMLA。后来报道产PMLA的菌种主要有出芽短梗霉［8-9］、环状青霉［7］和黏菌［10］等。在生物发酵制备聚苹果酸的菌种

中，由于出芽短梗霉的形态比较稳定，合成聚苹果酸的能力相对较强［11-12］，因此研究比较多的是出芽短梗霉。出芽短梗霉又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”，分类属于半知菌纲，是一种具有酵母型和菌丝形态的多形真菌［13-15］。目前国外对生物合成聚苹果酸的研究较多，以生产菌种的研究为主。国内对PMLA的研究较少，主要是一些优良菌株的选育［16］和发酵条件的优化［6］等，也有少量专利［17-18］是通过添加维生素和表面活性剂等来提高出芽短梗霉合成PMLA的效率。目前国内外没有关于氨基酸对PMLA产量，尤其是分子量的影响研究。目前微生物发酵生产PMLA产量不高，成本巨大是困扰发酵法制备PMLA的主要问题。

本文旨在研究添加不同氨基酸对出芽短梗霉PMLA产量和分子量的影响，并通过单因素和正交实验对提高PMLA产量和分子量的氨基酸组合进行优化，为以后聚苹果酸的大规模生产及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337） 源于天津北洋百川生物技术有限公司；斜面培养基 PDA培养基；种子培养基（g/L） 蔗糖60，酵母膏3，丁二酸2，硫酸铵1，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.005，玉米浆0.1%（V/V），CaCO320（单独灭菌）；基础发酵培养基（g/L） 蔗糖100，蛋白35，KH2PO40.1，NaNO32，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MnSO40.05，CaCO320（单独灭菌）；氨基酸类：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及组氨酸（His） 均为分析纯，源于美国Biotopped进口分装；苹果酸标准品 分析纯，购于百灵威科技有限公司；葡聚糖标准品 分析纯，北京奥博星生物技术有限公司。

UVmini-1240紫外/可见分光光度计 日本岛津公；SKY-2102摇床 上海苏坤实业有限公司；YJ-875S医用超净台 苏州净化设备厂；SPK-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LD5-10高速离心机 北京医用离心厂；Agilent1100高效液相色谱分析仪 美国Agilent；Prevail C18色谱柱（4.6 mm×150 mm）、凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）

百灵威科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 斜面培养 将保存于4℃的斜面菌种取出用接种针转接到新鲜的斜面上，并置于25℃恒温培养箱中，培养4～5 d。

1.2.1.2 种子培养 取出培养好的新鲜斜面菌种，在无菌操作条件下，用10 mL无菌生理盐水将培养基表面的孢子洗下，置于预先加好玻璃珠的无菌三角瓶内摇匀，制成孢子悬液。将该孢子悬液按照10%（V/V）的接种量，即取5 mL接种到装有45 mL种子培养基并灭好菌的500 mL挡板瓶中，用八层纱布封好瓶口，置于25℃恒温摇床上，转速200 r/min培养40 h。

1.2.1.3 摇瓶发酵培养 将培养好的种子液于无菌条件下混合均匀，按照10%（V/V）的接种量，将种子液接种到装有45 mL基础发酵培养基并灭好菌的500 mL挡板瓶中，用八层纱布封好瓶口，置于25℃恒温摇床，在200 r/min的转速下培养6 d。

1.2.2 氨基酸添加量对PMLA产量的影响 向基础发酵培养基中分别添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及组氨酸（His）。添加量分别为0.1～0.6 g/L，按摇瓶发酵培养方法培养，设置两组空白对照，每组实验做三个平行，每组数据重复三次，下同。

1.2.3 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337菌体量的影响 向基础发酵培养基中分别按1.2.2确定的最佳添加量添加各氨基酸，按照摇瓶发酵培养方法进行发酵实验，检测添加氨基酸发酵后A.pullulans CGMCC3337菌体量，设置两组空白对照实验，每组氨基酸分别做三个平行。

1.2.4 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337合成PMLA产量的影响 向基础发酵培养基中分别按1.2.2确定的最佳添加量添加各氨基酸，按照摇瓶发酵培养方法进行发酵实验，检测添加氨基酸发酵后PMLA的产量，设置两组空白对照实验，每组氨基酸分别做三个平行。

1.2.5 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影响 向基础发酵培养基中分别按1.2.2确定的最佳添加量添加各氨基酸，按摇瓶发酵培养方法进行发酵实验，检测添加氨基酸发酵后PMLA的分子量，设置两组空白对照，每组实验做三个平行。

1.2.6 正交实验设计 根据单因素实验结果，采用L18（37）正交表，选择Asp（A）、Leu（B）、Val（C）及Thr （D）为优选因素，以PMLA产量和分子量为考核指标，进行正交实验，因素与水平设计见表1。

表1 正交实验设计各因素及水平Table1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.2.7 检测方法

1.2.7.1 菌体量测定 取10 mL发酵液于50 mL离心管中，5000 r/min离心15 min。倒掉上清，在菌体沉淀中滴加3 mol/L的稀盐酸溶液，中和发酵液中剩余的碳酸钙，直到不再有气泡产生为止，5000 r/min离心15 min，倒掉上清。用10 mL生理盐水重悬菌体，

5000 r/min离心15 min，倒掉上清，将离心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，称量菌体干重（g/L）。

1.2.7.2 发酵液中PMLA的测定 取10 mL发酵液于15000 r/min离心10 min除去菌体，用移液管取5 mL上清液，加入等体积的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃条件下水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，结合苹果酸的标准曲线可得出样品中苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量［19］。

其中HPLC的检测条件如下：色谱柱：Prevail C18色谱柱（4.6 mm×150 mm）；柱温：25℃；流动相：25 mmol/L KH2PO4溶液/乙睛=95/5（V/V）（用磷酸调节pH至2.5）；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；紫外检测波长：210 nm。

苹果酸标曲的制作：选取浓度在1～10 g/L的苹果酸标准品，采用同样的条件进行HPLC检测，然后以苹果酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行标准曲线的绘制。

1.2.7.3 发酵液中PMLA分子量的测定 取10 mL发酵液于15000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液用流动相0.05 mol/L Na2SO4溶液稀释20倍，GPC检测PMLA分子量。

GPC测定发酵液中PMLA的分子量，采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定，首先使用分子量能够覆盖聚苹果酸分子量的葡聚糖标准品进行标准曲线的绘制，再结合使用高效液相色谱仪和凝胶色谱柱测定发酵液中PMLA的分子量。最后根据标准曲线换算即可得出PMLA的分子量。其中GPC检测PMLA分子量条件如下：色谱柱：凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温：25℃；参比池温度：30℃；流动相：0.05 mol/L Na2SO4溶液，pH自然；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL。

1.3 数据处理

每个实验共设3个平行，正交实验部分采用SPSS软件进行数据分析，图表生成采用Origin 7.5软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸添加量对PMLA产量的影响

按照1.2.2的实验方法进行实验，检测基础培养基中添加氨基酸发酵后聚苹果酸的产量，结果如表2所示。由表2可知，随着氨基酸添加量的增加，PMLA的产量先增加后减小。这是由于氨基酸能够促进聚苹果酸的合成，参与其合成途径，当氨基酸量达到一定时，会起到抑制作用和反馈调节作用，导致聚苹果酸的合成量降低。表3为由表2数据得到的各种氨基酸的最佳添加量。

2.2 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337菌体量的影响

按照1.2.3的实验方法进行实验，检测添加氨基酸发酵后A.pullulans CGMCC3337菌体量的变化情况，实验结果见图1。

由图1可知，菌体量均匀分布在30～35 g/L之间，其中谷氨酸（Glu）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg）和空白对照相比分别增加了2.95%、3.55%、1.18%、3.55%、2.96%、1.16%、2.96%、1.48%、4.14%、3.25%、3.54%。实验结果表明，在基础发酵培养基中添加氨基酸对出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337）菌体量影响不明显，因此要继续考察基础发酵培养

基中添加氨基酸对PMLA产量及分子量的影响。

表2 氨基酸以及添加量对PMLA产量的影响Table2 Effect of the types and adding amount of the amino acids on PMLA production

表3 氨基酸添加量Table3 The table of amino acid content

图1 不同氨基酸对菌体量的影响Fig.1 Effect of different amino acid on biomass

2.3 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337合成PMLA产量的影响

按照1.2.4的实验方法进行实验，检测添加氨基酸发酵后PMLA的产量，实验结果见图2。

图2 不同氨基酸对PMLA产量的影响Fig.2 Effect of different amino acid on PMLA

由图2可知，培养基中分别添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、组氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），与空白对照组41.21 g/L的产量相比分别提高了17.69%、12.42%、14.68%、14.54%、16.98%、 14.78%、12.86%、11.91%和12.86%。天冬氨酸对产物的合成影响最明显，可能是因为天冬氨酸通过转氨作用形成草酰乙酸，草酰乙酸再还原为苹果酸最终合成PMLA。培养基中添加赖氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）时，对PMLA合成几乎没有影响。而添加异亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）及苯丙氨酸（Phe）对PMLA合成有抑制作用。

2.4 氨基酸对A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影响

图3 不同氨基酸对聚苹果酸分子量的影响Fig.3 Effect of different amino acid on molecular weight

表4 正交实验表及结果Table4 Orthogonal analysis test

按照1.2.5的实验方法进行实验，检测添加氨基

酸发酵后PMLA的分子量，实验结果见图3。由图3可知，培养基中分别添加天冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）、苏氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）和亮氨酸（Leu），与空白对照组PMLA分子量6221.5 u相比分别提高了16.29%、16.19%、11.23%、16.67%、18.45%、13.85%、18.76%、19.00%、14.14%和19.58%。亮氨酸对PMLA分子量影响最明显，可能是因为亮氨酸对苹果酸聚合过程中某种酶有刺激作用。培养基中添加谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）及甘氨酸（Gly）对PMLA分子量的影响比较微弱，而添加丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）及丙氨酸（Ala）时，则出现了PMLA分子量较小的现象。由于分子量是评价作为药物载体性能的重要指标，能够用作药物载体的聚合物分子量范围是1.5～200 ku，在该范围内，适当提高聚苹果酸分子量，可以提高其载药量。因此，需要合成聚苹果酸分子量不能过小。

2.5 正交实验优化氨基酸添加量

正交实验结果见表4，聚苹果酸产量及分子量方差分析结果分别见表5和表6。

表5 聚苹果酸产量方差分析表Table5 The anova table of yield of PMLA

表6 聚苹果酸分子量方差分析表Table6 The anova table of molecular weight of PMLA

由表4～表6可以看出，氨基酸对PMLA产量和PMLA分子量的影响大小顺序分别为A＞B＞D＞C和A＞D＞B＞C，其中A因素对PMLA产量和分子量均有显著影响，B因素对PMLA产量有一定影响，D因素对PMLA分子量有一定影响。以PMLA产量和PMLA分子量为参考指标，确定添加氨基酸最优组合分别为A1B1C3D1和A1B1C2D1。由于C因素对PMLA产量和PMLA分子量的影响均最小，从节约成本考虑选择C因素最小添加量，因此确定添加氨基酸最优组合为A1B1C1D1，即：天冬氨酸（Asp）0.4 g/L、亮氨酸（Leu）0.4 g/L、缬氨酸（Val）0.4 g/L、苏氨酸（Thr）0.4 g/L，在此培养基条件下PMLA产量为58.42 g/L，PMLA分子量为8932 u。

2.6 验证实验

按最优组合方案中的氨基酸添加条件进行验证实验，重复实验3次，得到PMLA产量为57.89 g/L，PMLA分子量为8879 u，与预测值中PMLA产量58.42 g/L及PMLA分子量8932 u非常接近，产量和分子量与预测值分别相差0.9%和0.6%，较未添加氨基酸发酵所得PMLA产量和PMLA分子量分别提高了40.92%和45.20%。

3 结论

通过单因素实验，确定天冬氨酸、亮氨酸、缬氨酸以及苏氨酸对菌体生长及PMLA合成最有利。通过正交实验优化得到的添加氨基酸最优组合为（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、缬氨酸（Val）0.4、苏氨酸（Thr）0.4。在最优组合条件下获得的PMLA产量和分子量分别达到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸发酵所得PMLA产量和PMLA分子量分别提高了40.92%和45.20%。

本论文首次就氨基酸对聚苹果酸产量、尤其对PMLA分子量的影响进行研究。添加氨基酸提高聚苹果酸产量，有利于促进PMLA进一步实现工业化生产，为进一步解决困扰发酵制备PMLA产量不高、成本大的主要问题有着重要意义。提高PMLA的分子量，为其能更好的应用于医药载体方面起到了推动性作用。本论文在摇瓶发酵研究的基础上，会进一步进行发酵罐的扩大实验，并对氨基酸对聚苹果酸合成以及分子量影响的机理进行更深层次的研究。

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Effects of amino acids on poly malic acid fermentation by Aureobasidium pullulans

YIN Hai-song1，2，FAN Xu-jia3，TANG Wei-hua2，BIAN Yan-hui3，CHEN Shan2，QIAO Chang-sheng3，*
（1.School of Bioengineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Light Industrial Chemical Rresearch Institute of Co.，Ltd.，Tianjin 300350，China；3.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The effects of added amino acids on poly malic acid（PMLA）fermentation by A.pullulans CGMCC3337 were studied，the types and adding amount of the amino acids were optimized by single factor experiment and orthogonal experiments.Single factor experiment showed that aspartic acid（Asp），leucine（Leu），valine（Val）and threonine（Thr）were favorable for the synthesis of PMLA and cell growth.Orthogonal experiment showed that the optimal combination of amino acids added（g/L）：Asp 0.4，Leu 0.4，Val 0.4，Thr 0.4.Under the optimizing condition，the production and molecular weight of PMLA achieved 57.89 g/L and 8879 u，respectively.Compared with the previous，the production and molecular weight of PMLA were increased by 40.92%and 45.20%，respectively.

Aureobasidium pullulans；poly malic acid；amino acid

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0242-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.042

2015－10－26

殷海松（1980-），男，硕士研究生，副教授，研究方向：发酵工程，E-mail：yinhaisong1980@163.com。

*通讯作者：乔长晟（1969-），男，博士，教授，研究方向：发酵工程，E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。

天津市科技支撑计划重点项目（14ZCZDTG00025）。