岩藻聚糖硫酸酯酶提取方法比较研究及响应面优化

董书君，申晶晶，常耀光，薛长湖（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

岩藻聚糖硫酸酯酶提取方法比较研究及响应面优化

董书君，申晶晶，常耀光*，薛长湖
（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

为了研究海洋细菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127产胞内岩藻聚糖硫酸酯酶的高效提取方法，本研究比较了超声破碎、化学试剂法、溶菌酶法、渗透压作用、反复冻融等几种方法对Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞内岩藻聚糖硫酸酯酶的提取效果，确定超声破碎法为最优方法。进一步通过单因素实验及响应面实验考察了超声破碎各因素对提取效果的影响，建立了预测超声破碎法提取岩藻聚糖硫酸酯酶酶活的数学模型，并对各因素条件进行了优化。最终确立的超声破碎提取最佳条件为：破碎功率600 W，菌悬液浓度20 mg/mL，破碎总时长9 min，单次破碎时长为6 s，间歇时长4 s。利用优化方法可从单位质量（g）菌体中获得岩藻聚糖硫酸酯酶酶活（1640.47±84.81）mU/g，提取效果较优化前提高了56.80%。

岩藻聚糖硫酸酯酶，岩藻聚糖硫酸酯，超声破碎法，响应面优化，海参

糖苷酶是多糖改性研究的重要工具。岩藻聚糖硫酸酯是一类由岩藻糖和硫酸酯基构成的多糖类物质，广泛存在于褐藻和一些海洋无脊椎动物（例如海参等）体内，已经被证明具有多种生物活性，如抗凝血［1］、抗肿瘤［2］、调节免疫［3］、抗氧化［4］等，在功能食品、药品、化妆品开发等领域具有良好的应用前景。岩藻聚糖硫酸酯酶（EC 3.2.1.44）是一类能够降解岩藻聚糖硫酸酯的酶，能够切割岩藻聚糖硫酸酯中的糖苷键产生低分子量多糖和寡糖。目前，多种海洋微生物［5］、海参［6］及某些软体动物的消化道［7］等都被证实能够产生岩藻聚糖硫酸酯酶。

本课题组前期从近海海水中筛选得到一株细菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127，能够稳定的产生岩藻聚糖硫酸酯酶［8］。课题组已利用该酶成功制备出岩藻聚糖硫酸酯酶解寡糖，并通过解析寡糖结构解明了多种海参岩藻聚糖硫酸酯多糖的精细结构［9-12］。实验证实，利用该酶制备的岩藻聚糖硫酸酯低分子量多糖对化疗引起的肠道黏膜炎具有显著的改善效果［13］。针对Flavobacteriaceae sp.CZ1127产酶发酵条件的优化也已完成［14］。由于该酶主要产于胞内，获取具有一定的难度，因此如何实现该酶的高效获取成为制约其应用的关键。

本研究的目的在于比较研究并优化Flavobacteriaceae sp.CZ1127岩藻聚糖硫酸酯酶的提取方法。首先对超声破碎法、化学试剂法（Triton、SDS、乳化剂）、渗透压冲击法、反复冻融法、溶菌酶法的提取效果进行比较，初步筛选较优方法，在此基础上结合单因素实验及响应面实验（response surface methodology）对处理条件进行进一步优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Flavobacteriaceae sp.CZ1127 分离于近海海水［8］；岩藻聚糖硫酸酯 提取自海地瓜体壁，提取方法如文献［15］；对羟基苯甲酰肼（pHBH） Alfa Aesar公司；TritonX-100 AMRESCO公司；十二烷基硫酸钠（SDS） Sigma公司；吐温20、吐温40、吐温60、吐温80 天津博迪化工股份有限公司；溶菌酶 北京Solarbio科技有限公司；其他试剂 购于国药集团化学试剂有限公司。

HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨市东联生化仪器；scientz-650E超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-2550紫外可见分光光度计 SHIMADZU公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体发酵 从固体斜面接种Flavobacteriaceae sp.CZ1127于液体培养基［10］（岩藻聚糖硫酸酯0.2%，NaNO30.2%，MgSO40.5%，CaCl20.01%，Fe2（SO4）30.001%，过膜海水配制，pH7.0）中25℃培养48 h。培养结束后4℃离心（10000 r/min，10 min），沉淀以20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液（含5 mmol/L MgCl2）重悬并再次离心，收集沉淀得到菌体。

1.2.2 提取方法初筛

1.2.2.1 超声破碎法 菌体重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得20 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率500 W，单次破碎时长2 s，间歇时长2 s，工作总时长12 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.2.2 化学试剂法 将TritonX-100、SDS、吐温20、吐温40、吐温60及吐温80分别分散或溶解于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得各提取液，其浓度分别为0.75%（v/v）、0.03 mg/mL、0.2%（v/v）、0.2%（v/v）、0.2%（v/v）及0.2%（v/v）。将菌体以20 mg/mL的浓度重悬于各提取液，25℃震摇1 h后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.2.3 溶菌酶法 将菌体以20 mg/mL浓度重悬于溶菌酶溶液（10 mg/mL，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0），37℃孵育1 h后4℃离心（10000 r/min，10 min）取上清得到酶液。

1.2.2.4 渗透压冲击法 菌体以20 mg/mL浓度重悬于高渗透压溶液（含0.15 g/mL蔗糖及0.5 mg/mL EDTA的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液）中，冰水浴0.5 h后4℃离心（12000 r/min，10 min），收集沉淀菌体并向其中加入与高渗透压溶液相同体积的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液，冰水浴0.5 h后离心收集菌体，重复上述操作，取上清作为酶液。

1.2.2.5 反复冻融法 菌体以20 mg/mL重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中，-40℃冷冻2 h后置于25℃融化，反复冻融5次，4℃离心（10000 r/min，10 min）收集上清得到酶液。

测定各酶液中的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活，并计算各提取方法从单位质量（g）菌体中获得酶活总量，筛选出较优方法。

1.2.3 超声破碎法条件的单因素实验

1.2.3.1 超声破碎功率的选择 菌体重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得20 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率分别选取300、400、500、600 W，单次破碎时长2 s，间歇时长2 s，工作总时长12 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.2 超声破碎总时长的选择 菌体重悬于20mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得20 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率为600 W，单次破碎时长2 s，间歇时长2 s，工作总时长选取6、9、12、15 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.3 超声破碎菌悬液浓度的选择 菌体重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中分别制得10、20、30、40 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率为600 W，单次破碎时长2 s，间歇时长2 s，工作总时长选取9 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.4 超声破碎单次破碎时长的选择 菌体重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得20 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率为600 W，单次破碎时长选取2、5、8、10 s，间歇时长2 s，工作总时长选取9 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.5 超声破碎间歇时长的选择 菌体重悬于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液中制得20 mg/mL菌悬液。将菌悬液置于冰水浴中进行超声破碎，超声功率为600 W，单次破碎时长取5 s，间歇时长选取1、2、3、5 s，工作总时长选取9 min。处理完毕后4℃离心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.4 超声破碎法条件的响应面法优化 在单因素实验的基础上，根据Central Composite Design中心组合实验设计原理，以破碎总时长（X1）、单次破碎时长（X2）及间歇时长（X3）为自变量，以单位质量（g）菌体中获得的酶活总量（Y）为响应值，设计三因素五水平实验。实验因素及其水平的取值见表1。

表1 响应面实验因素编码及水平表Table1 Experimental factor coding and levels

1.2.5 酶活测定方法 岩藻聚糖硫酸酯酶酶活的定量依据课题组前期建立的pHBH法进行［16］：将0.375 mL底物溶液（2 mg/mL岩藻聚糖硫酸酯溶于20 mmol/LpH7.2 Tris-HCl）与0.375 mL酶液混合，28℃反应0.5 h后加入0.25 mL pHBH试剂（0.2 g/mL pHBH溶于2 mol/L的HCl，反应前与2 mol/L NaOH按照体积比1∶9混合），于100℃反应5 min，冷却后于415 nm检测吸光值，根据单位时间内还原糖的产生量计算酶活。1 mL酶液1 min内水解岩藻聚糖硫酸酯产生1 μmol糖苷键的活力定义为1 U。以mU/g作为单位质量（g）菌体中获得的酶活总量的单位。

1.2.6 统计分析 各实验重复3次，结果以平均值表示。方差分析采用SPSS 19.0软件，显著性差异分析采用LSD测试。响应面实验数据采用Design Expert 8.0.6.1软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法的比较研究

利用超声破碎法、化学试剂法（Triton、SDS、吐温）、溶菌酶法、渗透压冲击法及反复冻融法处理Flavobacteriaceae sp.CZ1127菌体，所得酶液中的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活列于表2。其中，超声波破碎法提取效果最佳，酶活达（1046.24±58.16）mU/g。

超声波破碎法是破碎细胞常用方法之一，其利用超声波产生的与细胞震动频率不同的高频振动，产生空化现象引起冲击波和剪切力，造成细胞结构破坏，进而释放胞内物质［17］。Silchenko［18］、Sakai［6］及Kim等［19］均利用该方法破碎细菌，获取胞内岩藻聚糖硫酸酯酶。

TritonX-100处理、SDS处理、渗透压冲击和反复冻融法均能不同程度释放胞内酶活。TritonX-100及SDS属于表面活性剂，具有较强的亲脂性，可能通过破坏细胞壁及细胞膜中脂质分子的致密性、增加膜结构的通透程度，实现胞内酶释放。渗透压冲击法利用高渗透压及低渗透压的转换使细胞发生溶胀，释放胞内物质。反复冻融中，细胞在冷冻条件下形成胞内冰晶，引起细胞液浓度升高导致细胞溶胀，同时冰晶的反复形成与消融也可造成细胞膜结构的破坏，从而释放胞内物质［16］。

吐温20、吐温40、吐温60及吐温80为食品工业中常用的乳化剂，表面活性相比TritonX-100较差，可能导致其提取效果较低。溶菌酶能够破坏细菌细胞壁肽聚糖从而破坏细胞壁结构，常用于革兰氏阳性菌胞内物质的提取，由于Flavobacteriaceae sp.CZ1127属于革兰氏阴性菌［8］，细胞壁中肽聚糖含量较少，因此溶菌酶处理的效果较差。

基于上述结果，选择超声破碎法进行进一步条件优化。

2.2 单因素实验

2.2.1 超声破碎法功率的选择 当破碎功率300～600 W范围内，提取效果不存在显著性差异（p＞0.05）（图1），说明在选定范围内破碎功率对提取效果的影响较小，因此不对该因素进行后续优化。由于破碎功率为600 W时提取效果的数值最高，选定600 W为最终条件。

图1 功率对超声破碎法提酶效果的影响Fig.1 Influence of power on the performance of ultrasonic extraction

2.2.2 超声破碎总时长的选择 随着破碎总时长增加，单位菌体中提取得到的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活总量呈现先增加（6～9 min）后下降（9～12 min）的趋势（图2）。破碎时长不足将导致细胞破碎不完全，随着破碎总时长的延长，细胞破碎完全，胞内酶完全释放，检测到酶活升高；然而破碎总时长过度延长将导致超声波热效应增强，造成酶的失活。

图2 破碎总时长对超声破碎法提酶效果的影响Fig.2 Influence of totle ultrasonic time on the performance of ultrasonic extraction

2.2.3 超声破碎菌悬液浓度的选择 超声破碎的处理效果随着菌悬液浓度的增加呈现先增加后下降的趋势（图3），当菌悬液浓度为20 mg/mL时，效果最佳。当菌悬液浓度较低时，超声波在提取液中传递的过程能量损失严重，因此细胞破碎效果较差，提取酶活较低；菌悬液浓度的提高可能会减弱超声破碎所形成空穴效应的强度，从而导致破碎效果减弱。

2.2.4 超声破碎单次破碎时长的选择 当单次破碎时长在2～5 s范围内，超声破碎的提取效果随单次破碎时长的延长而增加，在5～10 s内基本稳定，推测此时菌体破碎已较为充分（图4）。

表2 不同提取方法对岩藻聚糖硫酸酯酶的提取效果Table2 Enzyme activities of fucoidanase extracted by using different methods

图3 菌悬液浓度对超声破碎法提酶效果的影响Fig.3 Influence of bacterial concentration on the performance of ultrasonic extraction

图4 单次破碎时长对超声破碎法提酶效果的影响Fig.4 Influence of single ultrasonic time on the performance of ultrasonic extraction

2.2.5 超声破碎间歇时长的选择 由于超声破碎会产生热效应，处理时需将菌悬液置于冰水浴环境，设置适当的间歇时长也是消除热效应的有效手段。在1～3s范围内，间歇时长的延长将提高超声破碎的提取效果；在3～5s范围内，提取效果基本稳定（图5）。

图5 间歇时长对超声破碎法提酶效果的影响Fig.5 Influence of interval time on the performance of ultrasonic extraction

2.3 超声破碎法条件的响应面法优化

2.3.1 模型建立与显著性分析 响应面法可在较少实验次数的情况下，全面考察各种因素及其交互作用对结果的影响，快速、准确确定最佳条件。根据上述单因素实验的结果，破碎总时长（X1）、单次破碎时长（X2）和间歇时长（X3）三个因素对超声破碎的提取效果有明显影响，且依据超声破碎的原理预测三者可能存在交互作用，因此进一步利用响应面实验对上述三个因素的条件进行优化。响应面实验各组结果见表3，利用Design Expert软件对表3数据进行回归拟合，建立的数学模型如下：Y=1526.26-0.045X1+42.52X2+58.87X3-1.40X1X2+3.73X1X3+17.42X2X3-32.90X-42.68X-36.42X。

表3 响应面实验设计及结果Table3 Response surface methodology experimental design and results

模型的方差分析结果列于表4。数据显示，拟合的模型具有高度显著性（p=0.0027＜0.01），失拟项在α=0.05水平上不显著（p=0.1106＞0.05），说明其他因素对实验结果干扰小。R2=0.86，拟合度＞85%，可用来预测超声破碎提取岩藻聚糖硫酸酯酶的效果。

表4 回归模型方差分析Table4 Analysis of variance（ANOVA）for regression model

模型回归系数显著性的检验结果见表5。X2和X3影响显著（p＜0.05），表明在超声破碎提取岩藻聚糖硫酸酯酶时，单次破碎时长和间歇时长对酶提取效果具有显著影响。

2.3.2 模型交互项的解析 破碎总时长与单次破碎时长对破碎提取酶液酶活的影响如图6所示。随破碎总时长或单次破碎时长的增加，酶活均呈现先增高后下降趋势。在破碎总时长及单次破碎时长较短的情况下，破碎效果不充分；当总时长及单次破碎时长较长时酶液酶活下降可能与超声波的热效应有关。

表5 回归模型系数的显著性检验Table5 Significance test of regression coefficients

图6 破碎总时长及单次破碎时长对破碎效果的交互影响Fig.6 The interaction effect of total ultrasonic time and single ultrasonic time on ultrasonic results

破碎总时长与间歇时长对破碎提取酶液酶活的交互影响如图7所示。随间歇时长的延长，酶液中的酶活呈现增加的趋势。随破碎总时长的延长，酶液中酶活呈现先增加后下降的趋势。

图7 破碎总时长及间歇时长对破碎效果的交互影响Fig.7 The interaction effect of total ultrasonic time and internal time on ultrasonic results

单次破碎时长和间歇时长对破碎提取酶液酶活的影响如图8所示。超声破碎的提取效果随着单次破碎时长和间歇时长的增加逐渐提高。

2.3.3 最优条件预测及模型验证 根据响应面实验所得结果及二次多项方程，利用Design Expert软件预测并修正后得到最优超声破碎条件为：破碎总时长9 min，单次破碎时长6 s，间歇时长为4 s，此条件下预测的单位质量菌体酶活为1569.83 mU/g。

图8 单次破碎时长及间歇时长对破碎效果的交互影响Fig.8 The interaction effect of single ultrasonic time and single ultrasonic time on ultrasonic results

为检验模型预测的准确性，按最优条件进行实验，结果表明该条件下的提取酶活为（1640.47± 84.81）mU/g，实测值与预测值相近且更高（误差4.50%），证实模型的准确性高。优化条件下的提取效果相较初筛时提高了56.80%，表明本实验的优化取得了较为理想的效果。

3 结论

超声破碎法是从Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞内提取岩藻聚糖硫酸酯酶的较优方法。超声破碎的单次破碎时长与间歇时长是影响处理效果的主要因素。本研究成功建立了以单位菌体酶活为响应值，以破碎总时长、单次破碎时长和间歇时长为自变量的数学模型。确定最佳破碎条件组合为：破碎总时长9 min，单次破碎时长6 s，间歇时长4 s，破碎功率600 W，菌悬液浓度20 mg/mL。在优化条件下，单位质量（g）菌体破碎后可得到（1640.47±84.81）mU/g酶活，较优化前提高了56.80%。研究结果可为该岩藻聚糖硫酸酯酶的高效提取提供指导，也为下一步对该酶的作用方式进行研究以及利用该酶制备岩藻聚糖硫酸酯寡糖奠定了基础。

［1］Mourao P A.Use of sulfated fucans as anticoagulant and antithrombotic agents：future perspectives［J］.Curr Pharm Des，2004，10（9）：967-981.

［2］张珣，王静凤，杨玉红，等.海参岩藻聚糖硫酸酯抑制小鼠肿瘤生长和转移及其作用机制的研究［J］.中国药理学通报，2011，27（8）：1098-1103.

［3］黄益丽，郑忠辉，苏文金，等.二色桌片参的化学成分研究Ⅲ.二色桌片参多糖-1──岩藻聚糖的免疫调节作用［J］.海洋通报，2001，20（1）：88-91.

［4］薛长湖，陈磊，李兆杰，等.岩藻聚糖硫酸酯体外抗氧化特性的研究［J］.青岛海洋大学学报：自然科学版，2000（4）：583-588.

［5］Descamps V，Colin S，Lahaye M，et al.Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae［J］.Marine Biotechnol，2006，8（1）：27-39.

［6］Sakai T，K Ishizuka，I Kato.Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterium［J］.Marine Biotechnol，2003，5（5）：409-416.

［7］Daniel R，Berteau O，Chevolot L，et al.Regioselective desulfation of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus：application to the structural study of algal fucoidan（Ascophyllum nodosum）［J］.European Journal of Biochemistry，2001，268（21）：5617-5626.

［8］Chang Y，Xue C，Tang Q，et al.Isolation and characterization of a sea cucumber fucoidan-utilizing marine bacterium［J］.Letters in Applied Microbiology，2010，50（3）：301-307.

［9］Yu L，Xu X，Chang Y，et al.Enzymatic preparation and structural determination of oligosaccharides derived from sea cucumber（Acaudina molpadioides）fucoidan［J］.Food Chemistry，2013，139（1-4）：702-709.

［10］Yu L，Ge L，Xue C，et al.Structural study of fucoidan from sea cucumber Acaudina molpadioides：a fucoidan containing novel tetrafucose repeating unit［J］.Food Chemistry，2014，142：197-200.

［11］Yu L，Xue C，Chang Y，et al.Structure elucidation of fucoidan composed of a novel tetrafucose repeating unit from sea cucumber Thelenota ananas［J］.Food Chemistry，2014，146：113-119.

［12］Yu L，Xue C，Chang Y，et al.Structure and rheological characteristics of fucoidan from sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Food Chemistry，2015，180：71-76.

［13］Zuo T，Li X，Chang Y，et al.Dietary fucoidan of Acaudina molpadioides and its enzymatically degraded fragments could prevent intestinal mucositis induced by chemotherapy in mice［J］.Food Funct，2015，6（2）：415-422.

［14］王春霞，段高飞，唐庆娟，等.细菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127产海参岩藻聚糖硫酸酯酶的发酵条件优化［J］.现代食品科技，2011（3）：332-336.

［15］常耀光.海参岩藻聚糖硫酸酯及其酶解产物的制备、结构与活性研究［D］.青岛：中国海洋大学，2010.

［16］张翠玉，薛长湖，于龙，等.基于pHBH法的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活测定方法［J］.中国食品学报，2013（7）：200-206.

［17］邓洁，程龙，刘谊，等.根肿（Plasmodiophora brassicae）休眠孢子的纯化和超声波破碎方法研究［J］.应用与环境生物学报，2006（2）：269-272.

［18］Silchenko A S，Kusaykin M I，Kurilenko V，et al.Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium，Formosa algae［J］.Marine Drugs，2013，11（7）：2413-2430.

［19］Kim W J，Koo Y K，Jung M K，et al.Anticoagulating activities of low-molecular weight fuco-oligosaccharides prepared by enzymatic digestion of fucoidan from the sporophyll of Korean Undaria pinnatifida［J］.Arch Pharm Res，2010，33（1）：125-131.

The study of extraction methods for fucoidanase and optimization using response surface methodology

DONG Shu-jun，SHEN Jing-jing，CHANG Yao-guang*，XUE Chang-hu
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In order to obtain high efficiency methods of extracting fucoidanase from Flavobacteriaceae sp.CZ1127，this study compared several kinds of methods，and ultrasonic method was selected as the best method.The single factor experiments and response surface methodogy were adopted to search optimalizing conditions of extraction fucoidanase.And a second order quadratic equation was established.Results indicated that the optimalizing conditions of ultrasonic were as follows:ultrasonic power 600 W，bacterial concentration 20 mg/mL，total ultrasonic time 9 min，single ultrasonic time 6 s and internal time 4 s.After optimization，the enzyme activity of fucoidanase by ultrasonic method was improved to（1640.47±84.81）mU/g，and the enzyme activity increased by 56.80%.

fucoidanase；fucoidan；ultrasonic method；response surface methodogy；sea cucumber

TS201.3

B

1002-0306（2016）02-0249-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.042

2015－06－10

董书君（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品酶学，E-mail：dongshujun927@163.com。

*通讯作者：常耀光（1985-），男，副教授，研究方向：海洋食品碳水化合物，E-mail：changyg@ouc.edu.cn。

国家自然科学基金（31471684）；高等学校博士学科点专项科研基金（20110132120015）。