高效液相色谱串联质谱法同时测定9种龙虾中氨基糖苷类和四环素类抗生素残留

苏 晶，汤立忠，陈长毅，陈 枚，刘 洋（淮安市产品质量监督检验所，江苏淮安223001）

高效液相色谱串联质谱法同时测定9种龙虾中氨基糖苷类和四环素类抗生素残留

苏 晶，汤立忠，陈长毅，陈 枚，刘 洋
（淮安市产品质量监督检验所，江苏淮安223001）

建立了龙虾中6种氨基糖苷类和3种四环素类抗生素残留的高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）同时检测方法。样品中抗生素采用5%三氯乙酸-磷酸盐溶液提取，经超声萃取、固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，对样品前处理条件、液相色谱分离条件和质谱检测条件进行了优化。通过实际样品添加回收率实验，链霉素、双氢链霉素、四环素、金霉素和土霉素定量检出限均为5 μg/kg，庆大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素定量检出限均为50 μg/kg，9种抗生素三个添加水平下，龙虾样品加标回收率在66.1%～107.9%，相对标准偏差在0.7%～9.7%。结果表明，该方法准确、高效，适用于龙虾中6种氨基糖苷类和3种四环素类药物残留的同时检测和确证。

高效液相色谱串联质谱，氨基糖苷类抗生素，四环素类抗生素，龙虾

抗生素在我国畜牧和水产养殖中，不但被广泛应用于防治各种动物性疾病，而且常被添加到饲料中，用于促进动物的生长发育［1-2］，这不可避免造成抗生素在食品中的残留，对食品安全、生态环境和人体健康造成直接或潜在的危害［3］。氨基糖苷类抗生素和四环素类抗生素均为广谱抗菌药，广泛用于防治动物和水产品的疾病感染和促进生长［4-5］。目前，许多国家和地区制定了四环素类和氨基糖苷类药物最大残限量，国际贸易中也有严格的限定。联合食品添加剂委员会、欧盟、美国及日本对肉中四环素类和氨基糖苷类药物残留的最大限量在50～600 μg/kg之间［6-7］。我国规定鱼虾肉中四环素、土霉素、金霉素的最高限量为100 μg/kg，肌肉中新霉素最高限量为500 μg/kg，庆大霉素为100 μg/kg［8］。韩国和日本对我国出口水产品中氨基糖苷类药物残留要求控制在200 μg/kg以下。

近年来，液相色谱串联质谱技术因能有效实现抗生素的确证和定量，成为研究关注的焦点。液相色谱质谱法检测蜂蜜［9］、乳制品［10-11］及动物源性食品［6，12］中氨基糖苷类的方法有较多报道。然而，该类抗生素具有较强的极性，在常规反相色谱柱上的保留性较差，常加入离子对试剂以增强其在色谱柱上的保留性［6］，但其对质谱离子化具有抑制作用。近年来发展起来的亲水作用色谱柱（HILIC柱）在该类抗生素检测分离上也开展了相关的研究［2］，但该色谱柱价格昂贵，成本较高。有关四环素类药物残留的液相色谱质谱检测法的报道越来越多，其共同特点是灵敏度高，涉及药物的种类更多［13-16］。目前，关于氨基糖苷类和四环素类药物残留同时检测的方法尚未见报道。本文采用超声提取、HLB柱净化法提取目标物，以C18柱进行分离，流动相中舍弃了离子对试剂的使用，建立了HPLC-MS/MS法同时测定龙虾中6种氨基糖苷类和3种四环素类药物残留的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、金霉素 纯度均≥90%Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈 色谱级，德国Merker公司；甲酸 色谱级，德国CNW公司；三氯乙酸（TCA）、Na2EDTA、磷酸二氢钾 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Poly-Sery HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）

上海安谱实验科技有限公司；实验用水 由Milli-Q纯水机制得。

台式高速冷冻离心机、TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪、Accela U-HPLC 美国Thermo公司；KH-100B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；T18型高速匀浆机 德国IKA公司；KW-80A型漩涡混合器 上海医科大学仪器厂；Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 熟龙虾样品取肌肉部分，用食品料理机匀浆，制成均匀样品，-18℃冷冻保存备用。

1.2.2 标准储备液的配制 分别称取各抗生素标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，氨基糖苷类抗生素以纯水定容至刻度，四环素类抗生素用乙腈水（体积比为50∶50）定容至刻度，得1.0 mg/mL各抗生素单标储备液，于塑料管中4℃避光保存。

1.2.3 混合标准使用液的配制 分别移取一定量的各抗生素单标储备液，用乙腈水（体积比为20∶80）稀释成5 μg/mL混合标准中间溶液。用乙腈-0.1%甲酸溶液（体积比为20∶80）将混合标准中间溶液配制成不同浓度的系列标准溶液。

1.2.4 样品处理 参考Tao等［6］的方法，并进行了改进。称取5.00 g均质后的龙虾样品置于50 mL离心管中，加入10 mL 5%三氯乙酸-10 mmol/L磷酸盐（含4 mmol/L Na2EDTA）提取液，高速匀浆1 min，超声提取10 min，4℃12000 r/min离心10 min。将上清液收集至另一离心管中，残渣再以10 mL提取液重复提取一次，收集两次上清液，调整pH，4℃12000 r/min离心10 min，取上清液备用。在取上清液10 mL全部通过HLB固相萃取柱（预先以5 mL甲醇，5 mL水活化），以5 mL水淋洗柱体，25 MPa加压抽干10 min。以6 mL甲醇洗脱柱体，于40℃氮气吹干，以2 mL乙腈-0.1%甲酸（体积比为20∶80）溶解，过0.22 μm微孔滤膜后待测定。

1.2.5 高效液相色谱串联质谱条件 色谱柱：Agilent Ecilpse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为0.05%甲酸乙腈，B为0.05%甲酸水；梯度洗脱程序见表为：15%A 0～1.0 min；15%～60%A 1.0～5.0 min；60%A 5.0～17.5 min；60%～85%7.5～10 min；85%～15%A 10～15 min；15%A 15～20 min，流速0.2 mL/min，柱温30℃，进样体积20 μL。质谱离子源为ESI（+），喷雾电压：4000 V；离子源温度：320℃；鞘气：245 kPa；辅气：70 kPa；碰撞池电压1.5 mTorr，各抗生素选择性反应监测（SRM）模式监测参数，见表1。

表1 9种抗生素质谱分析参数Table1 MS/MS parameters of 9 antibiotics

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

图1 不同pH对9种抗生素回收率的影响Fig.1 Effect of different pH values on extracted recoveries of 9 antibiotics

目前，肌肉组织中四环素类抗生素的提取方法已较成熟，主要以EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）提取液进行提取［13，15］。实验以该提取液同时提取氨基糖苷类抗生素和四环素类抗生素，其中链霉素、双氢链霉素、四环素、金霉素和土霉素添加量为25 μg/kg，庆大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素添加量为250 μg/kg，结果3种四环素类抗生素回收率均达85%以上，而6种氨基糖苷类抗生素回收率几乎为0。因此，实验考察了5%三氯乙酸-10 mmol/L磷酸盐（含4 mmol/L Na2EDTA）溶液对9种抗生素的提取回收率，以及调整提取液pH对回收率的影响。结果表明提取液pH的变化对6种氨基糖苷类抗生素的影响较大，当调整提取上清液pH至3.0时，9种抗生素回收率最好，回收率均大于65%，最高接近100%（见图1）。

2.2 质谱条件的选择

氨基糖苷类和四环素类抗生素在质谱上具有很强的正离子响应，因此选择正离子模式进行扫描。以1.0 μg/mL抗生素单标溶液采用蠕动泵进样分析，在正离子模式下，9种抗生素一级质谱均出现［M+H］+准分子离子峰，且丰度较大，因此选择分子离子峰作为母离子。分别对9中抗生素母离子进行轰击碎裂，得到特征碎片离子峰信息，确定各目标物的特征子离子，具体见表1。在SRM模式下优化碰撞能量、Tube lens去簇电压，最后在液相色谱联机条件下优化喷雾电压、离子化温度、鞘气和辅助气流量等参数，确定最佳质谱检测条件，见1.2.5所述。

2.3 色谱条件的选择

以C18色谱柱作为分析柱，流动相中为加入离子对试剂。通过系列实验，比较了Thermo Hypersil Gold C18（2.1 mm×100 mm，5 μm）、Waters Symmetry®C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18四种色谱柱对6种氨基糖苷类和3种四环素类抗生素的分离效果。结果表明9种抗生素在Thermo Hypersil Gold C18和Waters Symmetry®C18上几乎无保留，在Agilent Eclipse Plus C18和Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱上有保留性。Agilent Eclipse XDB-C18能够实现碱性、酸性和中性化合物的良好分离，在宽pH2～9范围内能提供良好的峰形，9种抗生素分离效果最佳，峰型良好，因此选择该色谱柱作为分析柱。比较了乙腈-水、甲醇-水为流动相、流动相中添加甲酸、乙酸、甲酸铵对抗生素色谱分离效果的影响，最终确定流动相为0.5%甲酸乙腈-0.5%甲酸水时，9种抗生素色谱分离和质谱响应效果最佳。通过优化梯度洗脱条件，获得了9个目标物合适的保留时间和峰形，9种抗生素SRM模式监测提取色谱图见图2。

2.4 方法的线性关系与检出限

图2 9种抗生素SRM选择监测提取色谱图Fig.2 SRM chromatograms of 9 antibiotics

以9种抗生素的色谱峰面积（Y）和质量浓度（X）做线性回归，结果显示链霉素、双氢链霉素、四环素、金霉素和土霉素在5～250 μg/L范围内，庆大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素在50～2500 μg/L范围内，线性关系均良好（r＞0.99），见表2。通过阴性龙虾样品加标测定，链霉素、双氢链霉素、四环素、金霉素和土霉素添加水平在5 μg/kg，其信噪比（S/N）均大于10，表明以上5种抗生素的定量检测下限可达5 μg/kg，卡那霉素、妥布霉、新霉素和庆大霉素素添加水平在50 μg/kg，其信噪比（S/N）均大于10，表明其定量检测下限可达50 μg/kg。

表2 9种抗生素的线性范围和线性方程Table2 Linear ranges and regression on equations for 9 antibiotics

表3 龙虾中9种抗生素的加标回收率和精密度（n=6）Table3 Results of recovery and repeatability for 9 antibiotics in crayfish（n=6）

2.5 方法的回收率和精密度考察

以均质后的空白龙虾样品添加标准溶液的方法进行加标回收率测定。四环素、土霉素、金霉素、链霉素和双氢链霉分别添加5、12.5、50 μg/kg 3个水平，庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素分别添加50、125、500 μg/kg 3个水平，按所建方法进行样品处理和测定，平均加标回收率和精密度见表3。结果显示，龙虾中9种抗生素平均加标回收率在66.1%～107.9%，相对标准偏差在0.7%～9.7%，能够满足检测方法的要求。

2.6 实际样品中9种抗生素残留检测

采用本方法对我单位2015年二季度送检的8个龙虾样品进行检测，未检出以上9种抗生素残留。

3 结论

建立了龙虾产品中链霉素、双氢链霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素6种氨基糖苷类和四环素、土霉素、金霉素3种四环素类抗生素残留的高效液相色谱串联质谱同时检测方法。该方法以5% TCA-磷酸盐缓冲液提取样品中目标物，以HLB柱富集净化，有效去除了基质干扰，提高了回收率。通过优化液相色谱和质谱检测条件，建立的HPLC-MS/MS方法具有较高的灵敏度和较低的检出限，在实际检测工作中具有良好应用价值。

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Simultaneous determination of nine aminoglycosides and tetracyclines antibiotics residues in crayfish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

SU Jing，TANG Li-zhong，CHEN Chang-yi，CHEN Mei，LIU Yang
（Huaian Institute of Supervision&Inspection on Product Quality，Huaian 223001，China）

A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/ MS）had been developed for simultaneous determination of 6 aminoglycoside and 3 tetracycline antibiotics residues in crayfish.The antibiotics were ultrasonic extracted from crayfish muscles with 5%trichloroacetic acid-phosphate buffer solution，purified by hydrophilic-lipophilic balance（HLB）cartridge and separated by C18chromatographic column.The pre-treatment method，chromatographic and MS/MS parameters were optimized.The limits of detection for streptomycin，dihydrostreptomycin，tetracycline，chlortetracycline and oxytetracy-cline were 5 μg/kg，respectively，and for gentamycin，kanamycin，neomycin andtobramycin 50 μg/kg，respectively.The recoveries of 9 antibiotics residues at three spike levels ranged from 66.1%to 107.9%with the relative standards deviations of 0.7%～9.7%.The established method was accurate and effective for confirmation and quantification of 9 different aminoglycoside and tetracycline antibiotics residues in crayfish.

HPLC-MS/MS；aminoglycosides；tetracyclines；crayfish

TS207.3

A

1002-0306（2016）02-0060-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.003

2015－06－10

苏晶（1984-），女，博士，高级工程师，研究方向：食品与农产品检测，E-mail：surpumpkin@163.com。

淮安市科技支撑计划项目（HAS2012052）。