LC-MS/MS法测定小鼠脑组织中色氨酸及其3种代谢物

田　欢,翟俊乐,李孟秋,刘新民,常　琪,潘瑞乐,张泽生,廖永红,*

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.中国医学科学院药用植物研究所,北京 100193)



LC-MS/MS法测定小鼠脑组织中色氨酸及其3种代谢物

田欢1,2,翟俊乐1,2,李孟秋1,2,刘新民2,常琪2,潘瑞乐2,张泽生1,*,廖永红2,*

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.中国医学科学院药用植物研究所,北京 100193)

目的:建立检测小鼠脑组织中色氨酸、5-羟基色氨酸、5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸含量的LC-MS/MS分析方法。方法:采用 TSK Gel amide 80(2.0 mm×15 cm,3 μm)色谱柱,柱温35 ℃,乙腈:甲酸铵水溶液(15 mmol·L-1,pH5.5)(40∶60,v/v)为流动相,流速0.4 mL·min-1,采用正离子多反应监测(MRM)模式进行扫描。结果:4种待测物均在5 min内完成测定,色氨酸、5-羟基色氨酸、5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸最低定量限分别为0.2、0.1、0.2、0.2 ng·mL-1,最低检测限分别为0.05、0.02、0.05、0.05 ng·mL-1,在1～500 ng·mL-1浓度范围内线性关系均良好,方法的精密度和加样回收率均符合生物样品的分析要求。将该方法应用于口服萱草花总黄酮的小鼠脑提取物检测后发现:脑内四种待测物浓度明显发生改变,且变化规律与阳性药物帕罗西汀相同。结论:本方法简便、准确、灵敏度高,专属性强,重复性好,适用于脑组织中色氨酸-五羟色胺代谢过程中的4种成分的测定,可应用于神经精神类药物的药理作用机制研究。

液相色谱-串联质谱联用,色氨酸,代谢产物,小鼠脑组织,萱草花总黄酮

抑郁症是严重威胁人类健康的常见疾病,在各类精神疾病中发病率最高[1]。抑郁症的发病机制目前不十分清楚,5-羟色胺(5-HT)缺乏是导致抑郁症发病的可能原因之一。5-羟色胺是色氨酸(TRP)的代谢中间产物,其代谢途径如图1所示。色氨酸代谢途径(5-羟色胺通路)[2-3]为色氨酸(TRP)经色氨酸羟化酶生成5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP),进一步脱羧生成5-羟色胺,最终代谢生成5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)。TRP水平降低可使5-HT的生成减少,引起情绪失调、抑郁及认知功能障碍等[4-5]。截止目前,色氨酸及其代谢路径中间产物同时被检测的分析技术未见报道,该检测技术的建立是全面探知抑郁症发病机制的技术保障。另外,现代药理学证明萱草花提取物具有镇静[6-8]、抗抑郁[9]作用,并提出萱草花抗抑郁作用可能与其中黄酮类物质有关。本文采用液相色谱与电喷雾离子阱串联质谱(Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Mass/Mass,LC-ESI-MS/MS)联用技术[10-12],建立了小鼠脑中色氨酸代谢途径(包括5-羟色胺)的快速分析的方法。通过对小鼠脑内4种待测物的检测说明,该方法可方便、快捷、准确地实现代谢过程的监控。并用建立的分析方法检测了小鼠口服萱草花总黄酮对急性抑郁模型脑组织中四种待测物变化的规律。

图1　色氨酸的代谢途径Fig.1　Catabolic pathways of TRP

1　材料与方法

1.1材料与仪器

萱草花采自湖南省衡阳市祁东县,萱草花总黄酮提取物由廖永红实验室提取、纯化、浓缩,贮存于4 ℃冰箱中备用;帕罗西汀购自中国食品药品检定研究所(产品批号010-67095219);TRP、5-HT、5-HIAA、3,4-二羟基苄胺(DHBA,内标)对照品均购自美国Sigma公司(产品批号分别为101451968,028K1582,1413645和0703232);5-HTP对照品购自北京坛墨质检科技有限公司(产品批号为20140903);甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

SPF级ICR雄性健康小鼠60只,体重(20±2)g,购自北京维通利华实验动物公司。实验喂养于实验动物房,自由供给标准饲料[13]和清洁饮用水,光照12 h:12 h(光:暗),室温22～25 ℃,许可证号SCXK(京)2012-0001。

1200型液相色谱系统美国Agilent公司;Q-Trap 5500型串联四级杆-离子阱质谱分析仪美国Applied Biosystems公司;Sorvall Legend Micro 17R微量离心机美国Thermo公司;CPA225D十万分之一电子天平德国sartorius公司;Vibra-Cell型超声波破碎仪美国Sonics公司;Vibra-Cell型超声波破碎仪美国Sonics公司。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件TSK Gel amide 80色谱柱(2.0 mm×15 cm,3 μm);柱温35 ℃;乙腈:甲酸铵水溶液(15 mmol·L-1,pH=5.5)(40∶60,v/v)为流动相;流速0.4 mL·min-1;进样量5 μL[14]。

1.2.2质谱条件质谱检测器采用电喷雾方式进行离子化,采用正离子化方式,以多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行扫描,离子源及其他相关参数优化为喷雾电压5500 V,离子源加热温度500 ℃,Gas1为50 Psi,Gas2为70 Psi,其他参数见表 1。

表1　检测离子对及质谱离子化条件

1.2.3对照品溶液的配制精密称取四种检测物对照品各2.0 mg,分别用含0.2%甲酸的甲醇-水(1∶1,v/v,下同)溶解配制成1 mg·mL-1的对照品储备液,于-20 ℃冰箱备用。同法配制0.3 mg·mL-1的 DHBA内标溶液。分别精密吸取四种检测物对照品储备液各40 μL,加含0.2%甲酸的甲醇-水至2 mL,混匀配制成20 μg·mL-1的混合对照品溶液,分别用含0.2%甲酸的甲醇-水稀释配制浓度分别为1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2和0.1 ng·mL-1的系列标准曲线混合液。对照品溶液均在每次用前新鲜配制。高、中、低质量控制样品通过添加适量对照品储备液到已测浓度的空白脑匀浆液中,然后分别稀释到5、50、500 ng·mL-1三个浓度。

表2　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的标准曲线和线性范围(n=5)

1.2.4供试品溶液的制备小鼠断头处死,冰台上立即取脑,放于冰冷的生理盐水中漂洗,用滤纸吸干水分后精密称重(精确至0.01 mg),加入0.3 mL生理盐水,在冰浴中超声匀浆得脑匀浆液。取脑匀浆液0.2 mL,加入冰冷乙腈0.6 mL沉淀蛋白,混匀后于4 ℃放置30 min,于4 ℃离心(12000 r·min-1)5 min,取上清液,每200 μL上清液中加入内标液(0.3 mg·mL-1DHBA)20 μL,混匀后精密吸取50 μL进行LC-MS/MS分析。

1.2.5标准曲线及线性范围取1.2.3项下各混合对照品溶液200 μL,分别加入0.3 mg·mL-1内标液 20 μL,混匀后取50 μL进行LC-MS/MS分析,以各检测物的质量浓度为横坐标,被测物与内标峰面积比为纵坐标,进行线性回归,得到标准曲线。

1.2.6精密度日内精密度(intra-day precision):同一组织匀浆液配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,以及配制加入相同量空白溶剂的空白脑组织液,分别精密吸取50 μL进行LC-MS/MS 分析,每个样品重复进样5次,计算TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA浓度的RSD为日内精密度。

日间精密度(inter-day precision):同一组织匀浆液配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,以及配制加入相同量空白溶剂的空白脑组织液分别精密吸取 50 μL进行 LC-MS/MS 分析,于1、2、3 d进样,每天连续进样 3次,计算 TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA浓度的RSD为日间精密度。

1.2.7加样回收率取脑组织匀浆液,作为回收率实验用样品,测定5次,求出匀浆中各物质平均含量作为基准值,随后分别加入5、50、500 ng·mL-1高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,各取5份,进行LC-MS/MS 分析,得到加样回收率。

1.2.8稳定性考察了四种对照质控样品在不同温度和贮存条件下稳定性。取脑组织匀浆液,配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3个浓度的混合对照质控样品溶液,分别在室温下放置8 h、-20 ℃冻融三个循环和-80 ℃放置30 d后,各进行三次LC-MS/MS分析测定样品中四种待测物的含量。稳定性用最终测定值与初始测定值的比值来表达。

1.2.9动物样品中含量的测定小鼠适应性喂养一周后随机分为5组,每组12只,分别为空白对照组、阳性对照组和3个不同剂量的萱草花总黄酮提取物[15-16]组(22.5,45.0和90.0 mg·kg-1,以生药量计),构建小鼠急性抑郁模型。空白对照组的小鼠每天灌胃给予饮用水,阳性对照组小鼠灌胃给予帕罗西汀(10 mg·kg-1),3个给药组小鼠灌胃萱草花总黄酮提取物,每天灌胃1次,连续15 d。于第16 d,颈椎脱臼处死,取全脑,按1.2.4项下方法处理和分析样品,计算脑组织中四种检测物的含量。

2　结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1专属性按“供试品溶液的制备”项下操作时不加入脑组织,分别制备空白对照,以及加入对照品溶液而制得的标准品对照。比较空白对照(A)、标准品对照(B)与脑组织样品(C)三者的提取离子流色谱图,结果表明脑组织中的内源性成分不干扰TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA的测定。

2.1.2标准曲线及线性范围按照1.2.1项和1.2.2项色谱和质谱条件,以标准品峰面积对浓度进行回归,结果见表2。按2.1.3项下方法配制 100 ng·mL-1的混合对照品溶液,用含0.2%甲酸的甲醇-水不断稀释,信噪比(S/N)为10∶1为最低定量限,信噪比(S/N)为3∶1是最低检测限,发现各待检物质的定量限介于0.1～0.2 ng·mL-1,达到生物样品液质检测的要求。

2.1.3精密度精密度结果见表3。四种检测物日内、日间精密度的RSD均小于7%,符合生物样品分析的要求[17]。

表3　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的精密度(n=5)

表4　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的加样回收率(n=5)

表5　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的稳定性(n=5)

2.1.4加样回收率加样回收率结果见表4。加样回收率在88.8%～105%之间,说明该前处理方法适用于生物样品的测定。

2.1.5稳定性稳定性结果表明室温条件下放置8 h、-20 ℃冻融三个循环和-80 ℃放置30 d内生物样品稳定性较好,无明显降解。

2.2动物样品中含量的测定

帕罗西汀是一种苯基哌啶类衍生物[18-20],是一种具有良好耐受性的抗抑郁药物,它可以从消化道被很好地吸收且不受进食的影响,能迅速提高5-HT神经突触间隙的5-HT浓度,其作用与抑制5-HT转运体,使5-HT的清除减低有关。脑组织中四种检测物的含量见图2,结果发现口服给予小鼠萱草花总黄酮提取物后,小鼠脑内四种检测物明显发生改变,且变化规律与阳性药物帕罗西汀相同,说明萱草花黄酮提取物有较显著的抗抑郁作用。

图2　口服给予萱草花总黄酮提取物后小鼠脑内4种检测物的变化(mean±SD,n=12)Fig.3　Changes of four analyses in mouse brainsafter oral administration of Hemerocallis Total Flavonoids Extract(mean±SD,n=12)注:与空白组比较 *p<0. 05,**p<0. 01。

3　结论

液液相色谱-串联质谱方法为近年来发展较快的分析手段,特别是在体内样品分析中。本研究建立了可同时测定脑组织样品中色氨酸3种代谢产物(包括5-HTP,5-HT和5-HIAA)的 LC-MS/MS 分析方法,实现了色氨酸五羟色胺代谢途径产物的同时测定。本方法中4种分析物性关系较好,方法回收率高,稳定性良好,且样品需要量小、操作简单。本研究利用液质联用的优势,分别优化液相条件和质谱条件,选择合适的电离模式,对质谱参数中的母离子、子离子进行了摸索,对裂解能量和碰撞能量进行了优化,最终实现对多种氨基酸的分离提取及确证,实现了它们的定性与定量分析。

5-HT是调节情绪,抗抑郁的重要神经递质,其水平的降低与抑郁症的发生发展有密切关系。所以监测抑郁症患者TRP及其主要代谢产物的变化,可以从整体上了解患者TRP代谢状况,对病情发展及预防有一定的帮助,而且可以对治疗患者的疗效进行观察,从而指导临床用药。研究中萱草花总黄酮提取物按22.5,45.0,90.0 mg·kg-1,给药剂量组与空白组相比,TRP,5-HTP,5-HT,5-HIAA含量均明显升高,萱草花总黄酮提取物具有一定的抗抑郁作用,其抗抑郁的作用机理可能与增加5-HT的含量有关,调节色氨酸-五羟色胺代谢来达到抗抑郁的效果,这可能是实现抗抑郁作用机制之一。

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Determination of Tryptophan and its three metabolites in mice brain tissue by LC-MS/MS

TIAN Huan1,2,ZHAI Jun-le1,2,LI Meng-qiu1,2,LIU Xin-min2,CHANG Qi2,PAN Rui-le2,ZHANG Ze-sheng1,*,LIAO Yong-hong2,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking UnionMedical College,Beijing 100193,China)

Objective:To establish a LC-MS/MS method for the determination of tryptophan(TRP)5-hydroxy-tryptophan(5-HTP),5-hydroxytryptamine(5-HT)and 5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA)in mouse brain tissues. Method:Chromatographic separation was performed on a TSK Gel amide 80 column(2.0 mm×15 cm,3 μm)at column temperature of 35 ℃. The mobile phase system was a mixture of acetonitrile-ammonium formate solution(15 mmol·L-1,pH=5.5)(40∶60)whereas the flow rate was set at 0.4 mL·min-1. The instrument was operated under the multiple reaction monitoring(MRM)mode using electrospray ionization(ESI)in the positive ion mode. Results:Four analyses were separated within 5 minutes. The lowest limits of quantification in tryptophan(TRP)5-hydroxy-tryptophan(5-HTP),5-hydroxytryptamine(5-HT)and 5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA)were 0.2,0.1,0.2 ng·mL-1and 0.2 ng·mL-1,respectively. The minimum detection limit were 0.05,0.02,0.05 ng·mL-1and 0.05 ng·mL-1,respectively. A good linear relationship was achieved within the concentration ranges from 1 to 500 ng·mL-1for the analyses. Precision and recovery of this method are in line with the requirements of biological sample analysis. The method was applied to determine the concentrations of four analyses in brain after oral administration of Hemerocallis flavonoid extract and results showed that four kinds of analyses were significantly changed which was similar with the positive drug of paroxetine. Conclusion:This method is simple,accurate,highly sensitive,strongly,specific and repeatable which indicated that is suitable for the determination of four metabolites of tryptophan-5-HT metabolic pathways in mice. This method could be used to the pharmacological mechanism of the neuropsychiatric drugs.

LC-MS/MS;tryptophan;metabolites;brain tissue of mice;Hemerocallis flavonoid

2015-05-15

田欢(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：m18634330761@163.com。

张泽生(1956-)，男，博士研究生，教授，研究方向：食品添加剂与功能配料，E-mail：zhangzesheng@tust.edu.cn。

廖永红(1969-)，男，博士研究生，研究员，研究方向：新型给药系统、新型生物相容聚合物材料及肿瘤靶向给药、神经精神性天然药物生物药剂学等研究方向，E-mail：yhliao@implad.ac.cn。

重大新药创制(航天应激所致认知功能损伤防治新型化合物DS的成药性研究，2012ZX09J12110-04C)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000