白背毛木耳多糖APP3a羧甲基化修饰工艺研究

陈　慧,陈义勇

(1.中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221008;2.常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟 215500)



白背毛木耳多糖APP3a羧甲基化修饰工艺研究

陈慧1,2,陈义勇2,*

(1.中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221008;2.常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟 215500)

以白背毛木耳多糖APP3a为原料,用碱性氯乙酸法制备羧甲基化白背毛木耳多糖(CM-APP3a),研究其羧甲基化的工艺。以羧甲基取代度为指标,通过单因素实验对氯乙酸用量、氢氧化钠用量、反应时间、反应温度等工艺参数进行研究,并用响应面Box-Behnken实验设计对羧甲基化工艺进行优化。实验结果表明,APP3a羧甲基修饰的最佳工艺条件为:反应介质为异丙醇,多糖APP3a 60 mg,氯乙酸用量1.45 g,氢氧化钠用量 2.48 g,反应温度55 ℃,反应时间3.5 h。在该优化条件下,羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)的取代度达为0.892,与理论预测值0.895相比,其相对误差为0.33%。说明通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

白背毛木耳多糖APP3a,羧甲基化,取代度,响应面

白背毛木耳(Auriculariapolytricha),属于真菌门担子菌纲,银耳目黑木耳科黑木耳属[1],是近年来新引进的一个木耳品种,分布在全国各地,它营养丰富,质地脆滑,含有丰富的多糖,根据研究表明白背毛木耳多糖具有提高免疫力[1]、抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗凝血、抗血栓、降血脂[4]等作用。

近年来,随着对多糖结构的研究表明,采用一定的方法对多糖化学结构进行适当的修饰,可在很大程度上提高多糖的生物活性,具有很好的应用前景。目前,多糖的硫酸化、羧甲基化和乙酰化已有了初步的研究[5-7]。多糖羧甲基化即指向多糖大分子链上引入羧甲基基团,多糖羧甲基化能增大多糖的溶解度和电负性,可以提高多糖的水溶性,能给多糖增加新的活性[8-11],因其成本低、操作简单及生成物毒性小等优点,已成为一种重要的多糖衍生化方法。

目前对白背毛木耳多糖的研究主要集中在提取、分离纯化等方面,而对白背毛木耳多糖化学结构修饰的研究还未见报道。基于白背毛木耳多糖单一组分在化学修饰的研究尚未见报道的现状,以前期分离得到的白背毛木耳多糖APP3a为研究对象,采用碱性氯乙酸法对白背毛木耳多糖APP3a进行羧甲基化修饰及其工艺研究,为白背毛木耳多糖及其衍生物在药品、保健食品领域的应用提供相关的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

白背毛木耳购于江苏省常熟市;氯仿、正丁醇、氯乙酸、异丙醇、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、酚酞等均为分析纯;聚酰胺树脂国药集团化学试剂有限公司;Sephadex G-200、DEAE-cellulose52、透析袋(截留分分子量3500)北京索莱宝科技有限公司。

HH-2智能数显恒温水浴锅金坛市杰瑞尔电器有限公司;真空冷冻干燥机Alpha 1-2 LD plus,德国CHRIST公司;高速冷冻离心机CR22GⅡ,日本HITACHI公司;722分光光度计上海菁华科技仪器有限公司;分析天平XS105 DualRange,瑞士METTLER TOLEDO公司;pH计Seven Easy S20K,瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2实验方法

1.2.1白背毛木耳多糖APP3a的制备白背毛木耳经洗涤、干燥、粉碎后,用95%的乙醇回流脱脂,以除去色素及脂溶性物质,干燥得到预处理的白背毛木耳粉末。准确称取50 g粉末,按料液比1∶40,提取温度80 ℃条件下提取3次,合并提取液,在3000 r/min条件下离心20 min,除去沉淀,收集上清液。将上清液减压浓缩至一定体积,经Sevage法除蛋白,聚酰胺树脂脱色后,用4倍体积95%的乙醇进行醇沉,沉淀经离心后冷冻干燥。将干燥后的多糖通过DEAE-cellulose离子交换柱分离纯化,分别收集所需洗脱液,透析、浓缩后冷冻干燥得到四个组分(分别命名为APP1,APP2,APP3,APP4),其中APP3占总洗脱量的39.2%,接着对APP3进一步分离,通过葡聚糖G-200凝胶柱分级纯化,得到单一组分,定义为APP3a。

1.2.2羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)的制备羧甲基化多糖(CM-APP3a)的制备按照文献[12]方法制备。称取APP3a 60 mg,置于20 mL 异丙醇中,磁力搅拌反应30 min,然后加入适量20% NaOH溶液继续搅拌反应1 h,再将一定量的氯乙酸溶于少量蒸馏水中,缓慢加入上述反应液中,混合液置于一定温度的恒温水浴锅中继续搅拌反应,待冷却至室温,用4 mol/L的盐酸中和至pH为中性,然后将混合液置于透析袋中,用蒸馏水透析48 h后,减压浓缩至一定体积,用4倍体积的无水乙醇在4 ℃下沉淀12 h,所得沉淀经冷冻干燥后得羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)。

1.2.3羧甲基取代度的测定羧甲基化取代度的测定采用碱滴定法[13-15]。准确称取10 mg CM-APP3a置于100 mL 烧杯中,加入0.2 mol/L HCl 溶液(70%乙醇溶液配制)4 mL,振荡反应3 h。用80%的乙醇水溶液洗涤固体,样品用0.01 mol/L 的标准NaOH溶液溶解,微热条件下使溶液成透明后,立即用0.01 mol/L标准HCl溶液反滴定,记录加入盐酸的体积VHCl。

式中:CNaOH为0.01mol/L;CHCl为0.01mol/L;W为多糖样品质量,g;B为每克样品消耗NaOH的物质的量,mmol/g。

1.2.4单因素实验

1.2.4.1氯乙酸用量对APP3a羧甲基化修饰的影响在NaOH用量为2.0g,反应时间为4h,反应温度为55 ℃,反应介质为异丙醇的条件下,分别考察不同氯乙酸用量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g)对取代度的影响。

1.2.4.2氢氧化钠用量对APP3a羧甲基化修饰的影响在氯乙酸用量为1.5g,反应温度为55 ℃,反应时间为4h,反应介质为异丙醇的条件下,分别考察不同氢氧化钠用量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g)对取代度的影响。

1.2.4.3反应温度对APP3a羧甲基化修饰的影响在NaOH用量为2.5g,氯乙酸用量为1.5g,反应时间为4h,反应介质为异丙醇的条件下,分别考察不同反应温度(40、45、50、55、60 ℃)对取代度的影响。

1.2.4.4反应时间对APP3a羧甲基化修饰的影响在NaOH用量为2.5g,氯乙酸用量为1.5g,反应温度为55 ℃,反应介质为异丙醇的条件下,分别考察不同反应时间(1、2、3、4、5h)对取代度的影响。

1.2.5响应面实验设计根据单因素实验结果,利用Design-Expert8.06 设计原理,设计氯乙酸用量、氢氧化钠用量、反应时间、反应温度4因素3水平的中心组合实验,水平因素表见表1所示。利用响应面分析与优化,得到最佳的APP3a多糖羧甲基化工艺条件。

表1　响应面分析实验因素与水平

1.2.6红外光谱分析取干燥的APP3a和CM-APP3a各3 mg,与一定量的溴化钾(KBr)混合后压片,在4000～400 cm-1进行红外光谱扫描。

1.3数据统计分析

采用PASW statistics 18软件实验数据进行差异显著性检验,ANVOA 程序用于方差分析,最小显著差异法(LSD)用于数据多重比较分析,采用Excel 2003软件作图。

2　实验结果与讨论

2.1单因素对APP3a羧甲基化修饰的影响

2.1.1氯乙酸用量对APP3a羧甲基化修饰的影响氯乙酸乙酸用量对APP3a羧甲基反应的影响见图1。由图1可知,随着氯乙酸的增加,多糖取代度先升高后降低,在氯乙酸用量为1.5 g时,羧甲基取代度达到最大,之后继续增加氯乙酸的用量,取代度逐渐下降。这是因为随着氯乙酸的增加,体系中的CH2COO-增多,使多糖反应的机率增大,但整个取代反应需要在碱性条件下进行,随着氯乙酸的增加,氯乙酸的水解加快,需要消耗一部分的NaOH,从而使整个反应体系的pH降低,致使取代度下降[16]。因此,确定最佳的氯乙酸用量为1.5 g。

图1　氯乙酸用量对取代度的影响Fig.1　Effect of chloroacetic acid amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.2氢氧化钠用量对APP3a羧甲基化修饰的影响NaOH用量对APP3a羧甲基反应的影响见图2。由图2可知,随着NaOH用量的增加,多糖取代度呈现先增加后降低的趋势,在NaOH用量为2.5 g时,取代度达到最大值。这是因为随着NaOH用量的增加,生成较多的多糖钠盐,增大了与氯乙酸反应的机率,使醚化反应更充分,从而增加了取代度。但过多的NaOH会导致部分副反应发生,降低氯乙酸的利用率,不利于取代反应,使取代度降低[17]。因此,确定最佳的NaOH用量为2.5 g。

图2　NaOH用量对取代度的影响Fig.2　Effect of NaOH amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.3反应温度对APP3a羧甲基化修饰的影响反应温度对APP3a羧甲基反应的影响见图3。由图3可知,随着温度的升高,多糖取代度先升高后降低,在反应温度为55 ℃时,多糖取代度达到最大值。这是因为温度过高时,氯乙酸水解副反应加快,不利于取代反应的进行,同时会加剧多糖在碱性介质中的降解,增加副反应的发生,使取代度降低。因此,确定最佳的反应温度为55 ℃。

图3　反应温度对取代度的影响Fig.3　Effect of reaction temperature on amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.4反应时间对APP3a羧甲基化修饰的影响反应时间对APP3a羧甲基反应的影响见图4。由图4可知,随着反应时间的增加,多糖取代度先升高后降低,在反应时间为4 h,取代度为最大值,这是因为随着时间的增加,活性中心明显增多,当反应时间超过4 h,副反应会增加,从而使取代度下降。因此,确定最佳的反应时间为4 h。

图4　反应时间对取代度的影响Fig.4　Effect of reaction time amount on substitution degree of CM-APP3a

2.2响应面方法确定APP3a羧甲基化工艺条件

2.2.1响应模型的建立与分析在单因素实验的基础上,用Design-Expert 8.06软件进行响应面实验设计,以取代度为响应值,结果见表2。根据响应面分析,得出回归模型参数的方差分析见表3。

由表3可知,模型的F值为47.64,p<0.0001,表明该模型是极显著的,具有统计学意义。失拟项p值为0.0541(>0.05),差异不显著,未知因素对实验结果干扰很小,说明残差均由随机误差引起。R2=0.9794,说明模型拟合程度良好,实验误差小,具有较好的可靠性,因此该模型可以反映响应值的变化。由Box-Behnken 实验拟合出的回归方程为:Y=0.89-0.015A-0.0051B+0.0068C-0.0020D+0.0098AB-0.060AC+0.000AD+0.021BC+0.027BD-0.023CD-0.096A2-0.071B2-0.015C2-0.12D2

式中:Y-取代度;A、B、C、D-分别为氯乙酸用量、NaOH用量、反应温度、反应时间。同时直观分析表3中数据,方程中AC,A2,B2,C2,D2为影响高度显著项(p<0.01),A,BC,BD,CD为影响显著项(p<0.05)。影响羧甲基取代度大小的主次顺序依次为氯乙酸(A)>反应温度(C)>NaOH用量(B)>反应时间(D)。

表2　响应面实验设计及结果

2.2.2响应面分析结果氯乙酸用量、氢氧化钠用量、反应温度以及反应时间之间的交互作用对多糖取代度的影响见图A～图D。响应面图和等高线图可直观反映各因素之间的相互作用,曲面陡峭表明因素对取代度的影响显著,曲线平缓则相反,表明因素对取代度的影响不显著[18]。等高线的形状反映两个因素交互作用的强弱,椭圆形表明交互作用强,影响显著,圆形则相反[19]。等高线密集表明对取代度的影响较大,稀疏表明影响较小[18]。

从图5可以看出,氯乙酸用量(A)是影响多糖羧甲基化取代度最为显著的因素。图5(A-D)为响应面图和等高线图,可以反映氯乙酸用量、氢氧化钠用量、反应温度、反应时间对羧甲基多糖取代度的影响。由图5B和图5C可见,各因素处于不同实验水平时,对响应值的影响呈现出不同的变化规律,响应曲面呈现出高度扭曲,说明BC(NaOH用量和反应温度)、BD(NaOH用量和反应时间)存在着显著的交互作用,这也与回归分析的结果一致(p分别为0.0462和0.0155),为影响显著项。图5A-5D所示,各等高线呈椭圆形,响应曲面走势剧烈,表明上述各因素之间交互作用较强。由表3可知AC之间的交互作用大于BD之间的交互作用,各因素的交互作用对取代度的影响由强到弱依次为AC、BD、CD、BC。

表3　回归模型方差分析

注:* 差异显著,p<0.05;** 差异极显著,p<0.01。

图5　两因素间交互作用的响应面图Fig.5　The response surface of two factor interactions

2.2.3最佳条件的确定及验证实验利用Design-Expert 8.06软件进行工艺参数的优化,建立了以羧甲基取代度为目标值,得到最佳的工艺条件为:反应介质为异丙醇,白背毛木耳多糖APP3a 60 mg,氯乙酸用量1.45 g,氢氧化钠用量 2.48 g,反应温度55.2 ℃,反应时间3.49 h,多糖羧甲基化取代度的预测值为0.895。考虑实际操作,调整后工艺参数为氯乙酸用量1.45 g,氢氧化钠用量 2.48 g,反应温度55 ℃,反应时间3.5 h,该最佳条件下测得多糖羧甲基化的取代度为0.892,与预测值0.895基本相符,其相对误差为0.33%,证实了预测实验的准确性和实用性。

2.3 红外光谱分析CM-APP3a和APP3a的红外光谱见图6,可见CM-APP3a和APP3a均具有多糖类物质的特征吸收峰:3400 cm-1左右为羟基(O-H)的伸缩振动吸收峰,2900 cm-1左右为次甲基(C-H)的伸缩振动吸收峰。由图6可以看出,白背毛木耳多糖APP3a经修饰后,在1600、1420和1330 cm-1处均出现强吸收峰,为-COO-的特征吸收峰,其中1600 cm-1左右处为C-O的非对称伸缩振动吸收峰,1420 cm-1左右处为C-O的对称伸缩振动吸收峰,这些都证明白背毛木耳多糖APP3a已成功羧甲基化。

图6　APP3a和CM-APP3a的红外光谱图Fig.6　Infrared spectra of APP3a and CM-APP3a

3　结论

本文以白背毛木耳多糖APP3a为原料,采用碱性氯乙酸法,以羧甲基取代度为指标,通过单因素实验及Box-Behnken响应面法实验设计,建立了响应面与各因素(氯乙酸用量、氢氧化钠用量、反应温度、反应时间)之间数学模型,得到回归方程,并以此模型预测了最佳工艺条件和最高取代度。由该模型分析可知,影响多糖APP3a羧甲基取代度的因素主次顺序为:氯乙酸>反应温度>NaOH用量>反应时间。确定最佳工艺参数:多糖APP3a 60 mg,反应介质为异丙醇,氯乙酸用量1.45 g,氢氧化钠 用量2.48 g,反应温度55 ℃,反应时间3.5 h,多糖羧甲基化取代度可达0.892,与预测值0.895无显著差异,说明该回归模型具有良好的预测性。

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Carboxymethyl modification ofAuriculariapolytrichapolysaccharide

CHEN Hui1,2,CHEN Yi-yong2,*

(1.School of chemical Engineering and technology,China University of mining and technology,Xuzhou 221008,China;2.School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Auriculariapolytrichapolysaccharide(APP3a)was carboxymethylated by the method of alkaline chloroacetic acid and its carboxymethylation process was studied. The process parameters including chloroacetic acid amount,sodium hydroxide amount,reaction time,temperature,were studied through the single factor(experiment,and the optimization of carboxymethylation were adopted by response surface experiments with Box-Behnken design. The experimental results showed that the optimal conditions ofAuriculariapolytrichapolysaccharide(APP3a)carboxymethylation were obtained as followed:isopropyl alcohol used as reaction medium,60 mg of APP3a,1.45 g of chloroacetic acid,2.48 g of sodium hydroxide,55 ℃ of reaction temperature,3.5 h of reaction time. Under this condition the maximum substitution degree of 0.892 was obtained. Compared to the theoretical value,the relative error was 0.33%. It showed that the regression equation by response surface optimization had certain practical significance.

Auriculariapolytrichapolysaccharide;carboxymethylation;substitution degree;response surface methodology

2015-04-29

陈慧(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：生物化工,E-mail：chenhuizjx@126.com。

陈义勇(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品科学与天然活性成分，E-mail：chzjx1016@126.com。

TS255.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000