响应面法优化超声-微波协同辅助提取橄榄多酚工艺研究

项昭保,刘星宇

(重庆邮电大学 生物信息学院,重庆 400065)



响应面法优化超声-微波协同辅助提取橄榄多酚工艺研究

项昭保,刘星宇

(重庆邮电大学 生物信息学院,重庆 400065)

目的:优化超声-微波协同提取橄榄多酚的工艺条件,为工业化生产中提取橄榄多酚提供参考。方法:在单因素实验的基础上,采用响应面法优化超声-微波协同提取橄榄多酚的提取工艺。结果:橄榄多酚最佳提取工艺为:微波功率为550 W,微波提取时间为4.4 min,超声功率为 330 W,乙醇浓度为62%,此条件下的橄榄多酚实际得率为6.33%,接近于模型预测值6.35%。结论:该工艺简便、快速、得率高,为工业化应用提供了精确有效的参考标准,为广泛开发利用橄榄资源提供了良好的参考价值。

橄榄,多酚,超声,微波,提取,响应面法

橄榄(Canariumalbum(Lour.)Raeusch.)是橄榄科橄榄属植物,为卫生部首批公布的药食两用物种,有较高的药用价值,《农书》、《增补本草备要》、《本草纲目》、《日华子本草》等阐明了橄榄具有消酒解毒、清咽生津作用,能治咽喉痛,有开胃、下气、止泻等功效。随着橄榄的广泛应用,国内外学者从橄榄中分离出了多种酚类物质,并证明了其具有较强的抗氧化[1],抗菌[2],抗炎[3],抗肿瘤[4]和抗乙肝病毒[5]等药理作用,橄榄多酚成为当前的研究热点。

超声波和微波作为现代化提取技术,与传统溶剂提取法相比,具有提取间短,提取效率高,能耗低等优点,在天然产物有效部位提取中广泛应用[6-8],但是超声-微波协同提取的报道较少,但效果更好。如闫海清[9]等运用超声微波联用技术提取蓝莓总多酚,优化结果表明超声微波联用技术较单一超声提取或微波提取能大大提高多酚得率。对于橄榄多酚的提取研究,罗永会等[10]采用传统乙醇浸提,最佳工艺需4 h,得率5.75%;曾培源等[11]采用超声辅助提取橄榄多酚,最佳工艺需提取3次,每次40 min,共2 h,得率2.32%;何志勇等[12]采用微波辅助提取橄榄多酚,最佳工艺仅需15 s,得率1.2%,传统提取法耗时但得率较高,现代提取法省时但得率较低,为提高现代提取技术橄榄多酚的得率,本文采用橄榄多酚的提取研究中未见报道超声微波协同提取技术,利用响应面法对橄榄多酚的提取工艺进行优化,为进一步推动橄榄多酚的工业生产和深加工,加大开发利用橄榄资源提供重要基础资料。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

橄榄采自重庆市江津区石蟆镇橄榄种植基地,晒干、打粉、过筛、备用;没食子酸标准品、福林酚试剂国药集团化学试剂有限公司;乙醇重庆川东化工有限公司;碳酸钠上海虹光化工厂;均为分析纯。

T6新悦型可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;20B型万能粉碎机江阴市祝塘永昌药化机械厂;Sartorius LE225D型电子分析天平苏州赛恩斯仪器有限公司;超声微波组合反应系统南京先欧仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1建立标准曲线精密称取没食子酸50 mg,用蒸馏水溶解,定容至100 mL,制备得0.50 mg/mL的标准液。再精密吸取1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 mL没食子酸标准液分别定容于25 mL容量瓶内,配成梯度质量浓度分别为 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL 的没食子酸溶液。然后从各稀释溶液中吸取1.00 mL加入25 mL容量瓶中,先加10 mL蒸馏水,摇匀,再加1.50 mL福林酚试剂,充分摇匀,5 min 后加入6 mL 10% Na2CO3溶液,定容,摇匀,然后在30 ℃避光放置反应60 min,以蒸馏水作参比,在765 nm处测定其吸光值[13]。以吸光值为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.2橄榄多酚得率的计算精密吸取1 mL多酚提取液,蒸馏水定容至25 mL容量瓶。再采用1.2.1的方法测定其吸光值。重复实验三次,橄榄样品中的总多酚含量以没食子酸标准品计。

多酚得率:Y(%)=ρ×A×V/(1000M)×100

式中,Y为橄榄多酚得率,%;ρ为待测液中多酚浓度,mg/mL;A为稀释倍数;V提取液总体积,mL;M为称取的橄榄粉末质量,g。

1.2.3单因素实验对橄榄多酚提取条件的优化

1.2.3.1超声波时间对多酚得率的影响称取1 g橄榄样品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分别在150 W超声波功率下各提取10、20、30、40、50、60 min。提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.3.2超声波功率对多酚得率的影响 称取1 g橄榄样品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分别在超声波功率为75、150、225、300、375、450 W条件下提取40 min。提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.3.3微波功率对多酚得率的影响称取1 g橄榄样品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超声波功率300 W提取40 min,分别在微波功率为350、400、450、500、550、600 W条件下协同提取1 min,提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.3.4微波时间对多酚得率的影响称取1 g橄榄样品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超声波功率300 W提取40 min,分别在微波功率为500 W条件下协同提取1、2、3、4、5、6 min,提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.3.5乙醇浓度对多酚得率的影响称取1 g橄榄样品6份,分别加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液30 mL,超声波功率300 W提取40 min,微波功率500 W条件下协同提取4 min,提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.3.6液固比对多酚得率的影响称取1 g橄榄样品6份,分别加入65%乙醇溶液10、15、20、25、30、35 mL,超声波功率300 W提取40 min,微波功率500 W条件下协同提取4 min,提取液按1.2.2法进行多酚得率的计算,重复实验三次。

1.2.4响应面法优化橄榄多酚的提取工艺在单因素实验的基础上,进行四因素三水平的Box-Behnken的中心组合设计,见表1,采用响应面法分析所选4个因子对响应值(橄榄多酚得率)的影响,同时优化橄榄多酚的提取工艺。每组实验重复三次。

表1　Box-Behnken的中心组合因素水平表

1.2.5统计分析单因素实验数据使用SPSS 19.0 软件进行显著性分析。响应面实验数据采用Design expert 8.0.6 进行数据处理。

2　结果与讨论

2.1标准曲线

据步骤1.2.1得回归方程:A=6.1977C+0.0592,R2=0.9987,表明在 0.025～0.150 mg/mL浓度范围内,没食子酸浓度C与吸光度A之间有着很好的线性相关性,如图1所示。

图1　没食子酸标准曲线Fig.1　Standard curve of gallic acid

2.2单因素实验结果

2.2.1超声波提取时间对多酚得率的影响由图2可知,在40 min内,随着超声波提取时间的增长,多酚得率逐渐增大,当提取时间延长到40 min后,多酚得率开始略有下降,但经显著性分析,无明显差异,与曾培源等[11]采用超声辅助提取橄榄多酚的单次提取时间40 min相同,因此在随后的实验中选择的超声波提取时间为40 min,且不作为响应面考察条件。

图2　超声波提取时间对橄榄多酚得率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on the yield of polyphenols注:图中不同字母表明差异性显著(p<0.05),相同字母表示无显著性差异(p>0.05),下同。

2.2.2超声波功率对多酚得率的影响由图3可知,随着超声波功率的增大,多酚得率逐渐增大,但是当超声波功率超过300 W以后,多酚得率开始明显下降。可能是由于大功率的超声波导致某些多酚物质结构被破坏,从而得率下降,这与王涓等[14]报道一致,故根据实验结果,选取超声波功率225、300、375 W作为响应面考察条件。

图3　超声波功率对橄榄多酚得率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.2.3微波功率对多酚得率的影响由图4可知,在500 W的微波功率内,随着功率的增大多酚得率逐渐增大,当微波功率为500 W时,多酚得率达到最大值。随后呈逐渐下降的趋势。可能是因为较大的微波功率使得多酚物质结构被破坏,从而导致得率下降,这与闫海清等[9]报道一致。故根据实验结果,选取微波功率450、500、550 W作为响应面考察条件。

2.2.4微波提取时间对多酚得率的影响由图5知,随着微波提取时间的增大,多酚的得率也随之增大,但是当提取时间大于4 min后,其得率开始呈现下降的趋势,可能是由于长时间的微波辐射,导致提取温度增大,某些多酚类物质被降解,从而导致多酚得率下降,这与闫海清等[9]报道一致。因此根据实验结果,选取微波提取时间3、4、5 min作为响应面考察条件。

图5　微波提取时间对橄榄多酚得率的影响Fig.5　Effect of microwave extraction time on the yield of polyphenols

2.2.5乙醇浓度对橄榄多酚得率的影响由图6知,乙醇浓度在45%～65%的范围内,随着浓度的增加,多酚得率也随之增大,但是65%的浓度范围以后,得率开始逐渐减少,原因可能是过高的乙醇浓度不能强有力地破坏橄榄中多酚类物质与蛋白质或其他物质的连接,使得多酚得率降低;但过低的乙醇浓度,会使糖类等水溶性杂质的浸出率提高,多酚的得率也会降低,这与饶瑜等[15]报道一致。所以根据实验结果,选取乙醇浓度55%、65%、75%三个水平作为响应面考察条件。

图6　乙醇浓度对橄榄多酚得率的影响Fig.6　Effect of the concentration of ethanol on the yield of polyphenols

2.2.6液固比对橄榄多酚得率的影响由图7知,液固比在10∶1～25∶1(mL/g)范围内,橄榄多酚得率随液固比的增加显著提高,当液固比超过25∶1(mL/g)时,多酚得率基本没有显著变化,其原因可能是在料液比为25∶1(mL/g)时,溶剂对多酚类物质溶解已达到平衡,增加溶剂量对增加多酚的得率几乎无影响,这与曾培源等[11]报道一致。故实验中选择的料液比为25∶1(mL/g),并且不作为响应面考察条件。

图7　液固比对橄榄多酚得率的影响Fig.7　Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polyphenols

2.3响应面法优化橄榄多酚的提取工艺

在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken中心组合进行四因素三水平的实验设计。以微波功率、微波提取时间、超声波功率和乙醇浓度为自变量,以橄榄多酚得率Y为响应值。实验设计及结果如表2。

表2　响应面分析方案及实验结果

表2中,1～24为析因实验,25～29为中心实验,29个实验点分为析因点和零点,其中析因点为因素A、B、C和D所构成的多维空间顶点,零点为区域的中心点,中心点实验进行5次,用以估计实验误差。根据表2的实验方案进行实验后,通过design expert 8.0.6软件对数据进行二次回归拟合,获得橄榄多酚得率对编码自变量微波功率、微波时间、超声功率和乙醇浓度的二次多项回归。根据实验结果建立的数学模型为:

Y=6.24+0.20A+0.23B+0.093C-0.41D-0.069AB-0.071AC-0.054AD-0.19BC-0.31BD-0.39CD-0.36A2-0.55B2-0.57C2-0.71D2

模型的可靠性可通过方差分析和相关系数来考察。当P(Pr>F)值小于0.01时影响为高度显著,P(Pr>F)值小于0.05影响显著。由表3的回归分析结果可知,模型的P(Pr>F)值<0.0001,说明回归方程具有高度的显著性。此外,R2=92.05%,表明响应值橄榄多酚得率实际值与预测值之间具有较好的拟合度,该实验方案是可行的。一次项B和D对Y值的影响高度显著(p<0.01),A对Y值也有显著影响(p<0.05),交互项CD影响极显著(p<0.01),BD也有显著影响(p<0.05),二次项A2,B2,C2,D2对Y值也有极显著的影响(p<0.01)。响应曲面图可以形象地描述各因素之间的相互作用,如图8～图13所示。

图8　微波时间和微波功率对多酚得率的交互影响Fig.8　Effect of microwave extraction timeand microwave power on the yield of polyphenols

图9　超声功率和微波功率对多酚得率的交互影响Fig.9　Effect of ultrasonic power and microwave power on the yield of polyphenols

表3　回归分析结果

图10　乙醇浓度和微波功率对多酚得率的交互影响Fig.10　Effect of the concentration of ethanoland microwave power on the yield

图11　超声功率和微波时间对多酚得率的交互影响Fig.11　Effect of ultrasonic power and microwave extraction time on the yield of polyphenols

图12　乙醇浓度和微波时间对多酚得率的交互影响Fig.12　Effect of the concentration of ethanoland microwave extraction time on the yield

图13　乙醇浓度和超声功率对多酚得率的交互影响Fig.13　Effect of the concentration of ethanoland ultrasonic power on the yield

注:**:差异高度显著(p<0.01);*:差异显著(p<0.05)。

当响应曲面坡度比较平滑,说明响应值受各个变量变化的影响较小,相反,当响应曲面坡度较陡峭,则说明响应值受变量交互作用较为明显。通过比较图8～图13,考察微波功率、微波时间、超声波功率和乙醇浓度四个因素两两之间交互作用对橄榄多酚提取的影响,可知乙醇浓度和微波时间以及乙醇浓度和超声功率之间存在明显的交互作用,这与响应面曲线的分析结果相一致。

2.4橄榄多酚最佳提取条件的确定及实验验证

通过design expert 8.0.6软件对响应面优化工艺结果分析得到最佳提取工艺为:微波功率为550 W,微波时间为4.4 min,超声功率为329.98 W,乙醇浓度为61.85%,此条件下模型给出的橄榄多酚得率预测值为6.35%。为验证响应面法所得预测值的可靠性,采用上述实验条件进行橄榄多酚提取的工艺验证,考虑到实验中实际操作的方便,将上诉工艺条件修正为超声波时间40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波时间4.4 min、超声功率330 W、乙醇浓度62%。在上述条件下进行平行实验三次,得到橄榄多酚得率的平均值为6.33%。此工艺参数下的结果与预测值非常接近,证明了响应面法优化橄榄多酚提取工艺参数的准确性和有效性,说明所建模型拟合良好且可靠。

3　结论

本实验是在六个单因素实验结果的基础上,选取四个对橄榄多酚得率影响较大的四个因素(微波功率、微波时间、超声功率和乙醇浓度)进行四因素三水平的响应面优化。从而得到了橄榄多酚的最佳提取工艺参数:超声波时间40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波时间4.4 min、超声功率330 W、乙醇浓度62%,在此条件下,橄榄多酚的得率可达6.33%,与预测值6.35%基本一致,说明响应面法得到橄榄多酚超声微波提取工艺的条件真实可靠。充分利用超声微波协同提取技术和响应面分析,得到的工艺简单、快速、得率高,很好地兼顾了橄榄多酚提取的省时和高得率。

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Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of polyphenol fromCanariumalbumby response surface methodology

XIANG Zhao-bao,LIU Xing-yu

(College of Bio-Information,Chongqing University of Posts and Telecommunications,Chongqing 400065,China)

Objective:The technology for ultrasonic-microwave synergistic extracting polyphenols fromCanariumalbumwas optimized,which can provide certain references for actual production. Methods:On the basis of single factor experiments,the optimum conditions for the extraction of polyphenol was obtained by response surface methodology. Results:The optimum conditions of extracting polyphenol fromCanariumalbumwere as follows:microwave power 550 W,microwave extraction time 4.4 min,ultrasonic power 330 W,ethanol concentration 62%. Under these conditions,the polyphenol yield was 6.33%,which was close to the model predictive value of 6.35%. Conclusion:the optimum process was simple and rapid,which had good yield. Furthermore,this study offered not only an accurate and effective reference standard for industrial applications,but also a good reference value for widely exploitation and utilization ofCanariumalbumresource.

Canariumalbum;polyphenols;ultrasonic;microwave;extraction;response surface methodology

2015-01-23

项昭保(1977-)，男，教授，主要从事天然产物成分研究工作,E-mail:xiangzb@126.com。

重庆市基础与前沿研究计划一般项目(CSTC2014jcyjA10099);重庆邮电大学大学生科研训练项目(A2014-49)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000