黑蒜加工过程中内生细菌的分离鉴定及其增效作用的研究

姬妍茹,石杰,王月明,2,刘宇峰,*,董艳,杨庆丽,张正海,3,刘玉

(1.黑龙江省科学院大庆分院,黑龙江大庆 163319;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆 163319)



黑蒜加工过程中内生细菌的分离鉴定及其增效作用的研究

姬妍茹1,石杰1,王月明1,2,刘宇峰1,*,董艳1,杨庆丽1,张正海1,3,刘玉1

(1.黑龙江省科学院大庆分院,黑龙江大庆 163319;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆 163319)

本文对黑蒜加工不同时期样品中的内生细菌进行分离鉴定,从中分离出1株芽孢杆菌,通过形态特征观察及16S rDNA序列测定对其进行鉴定,结果表明该菌为枯草芽孢杆菌,在大蒜汁培养基中生长时,具有生长旺盛、耐热性强、产黑色素的特点。将其回接到生蒜瓣上,50 ℃条件下48 h蒜瓣变为黑色,而未接种的蒜瓣则变为淡黄色,说明该菌液对大蒜由白蒜变为黑蒜有一定的贡献。这为研究黑蒜的形成机理提供了数据佐证,为进一步开发黑蒜发酵菌剂奠定了实验基础。

大蒜,内生细菌,黑蒜,枯草芽孢杆菌,促进发酵

植物内生细菌是指能在活体植物内定殖,不引起寄主植物组织结构发生明显变化,在正常情况下,不引起寄主植物出现病害症状的细菌[1]。内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间,不易受环境条件的影响,与寄主植物之间是一种和谐的共生关系[2]。内生菌可以产生多种次生代谢产物,这些产物具有多种生物活性,这些功能使得内生菌作为一种植物益生菌在生物农药、增产菌剂等多个领域发挥着重要作用。

大蒜是一种调味香辛类蔬菜[3],具有抗菌消炎、提高机体免疫力、预防和治疗心血管疾病、防治肿瘤等多方面的功能[4]。黑蒜是由新鲜的带皮生蒜在高温高湿的环境下,不添加任何添加剂自然发酵而成,是大蒜的深加工产品。与生大蒜相比,黑蒜没有了刺激性的蒜臭味,口感酸甜,而且粗蛋白和多酚等营养功效成分含量有一定的提高[5],深受消费者的喜爱。常规的黑蒜加工工艺生产周期较长,成本较高,价格居高不下,制约了黑蒜食品的发展。近几年,科研人员针对黑蒜工艺优化和改进方面开展了很多研究,罗仓学[6]等通过对发酵工艺中温度、时间等影响因素的实验分析,以黑蒜产品的感官评价及可溶性糖含量等为指标研究了温度对黑蒜发酵的影响,确定了液态黑蒜发酵的最佳工艺参数。安东[7]对大蒜在不同温度条件下的总酚、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、可溶性糖等含量的变化进行了研究,确定了黑蒜的有效熟化时间范围。

有关黑蒜工艺优化方面的相关文献较多,但是还没有涉及到将大蒜内生菌作为发酵菌剂应用到黑蒜加工过程中的报道,本实验从黑蒜加工不同时期的样本中进行大蒜内生菌的分离和鉴定,并将其回接到生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣上进行实验,以期获得能够促进黑蒜发酵的益生菌,研制出黑蒜发酵促进剂,为黑蒜加工工艺的优化提供一条新的解决途径。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大蒜为白皮分瓣蒜,黑龙江省阿城市;黑蒜以所购大蒜为原料利用单位自主研制的发酵设备加工获得。

细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂盒;DNA Marker 564bp/21226bp、柱式DNA胶回收试剂盒:上海生工生物公司;其他试剂均采用国产分析纯。

BSC-1360ⅡA2生物安全柜北京东联哈尔仪器制造有限公司;DYY-5电泳仪北京六一仪器厂;FR980凝胶像系统上海复日科技仪器有限公司;PCR仪;BK-5000电子显微镜重庆奥特光学仪器有限公司;LDZX-40SCI高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗仪器厂;HPX-9082MBE数显电热培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HZQ-X100振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2大蒜内生菌的分离和纯化

取适量黑蒜加工各阶段的样品,75%乙醇处理蒜瓣5 min,3%次氯酸钠处理10 min,再用75%乙醇处理1 min,最后用无菌水洗涤3次,用无菌的研钵磨碎后称量25 g,加入225 mL无菌水中充分摇匀,吸取1 mL注入9 mL无菌水中,梯度稀释到10-4、10-5,吸取1 mL,倾倒入上述三种培养基中,每个处理3次重复。PDA马铃薯培养基、孟加拉红培养基置于28 ℃恒温培养箱中,PCA细菌培养基置于37 ℃恒温培养箱和厌氧培养箱中培养28～72 h,适时检查菌落形态和生长情况,选择形态、大小和颜色等特征不同的菌落进行划线分离纯化,得到纯化菌株后,接斜面置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3菌株的活力比较

将耐高温的菌株接种到生蒜汁和熟蒜汁培养基上,培养48 h之后进行活菌数测定,选取活力最强的菌株作为促进黑蒜发酵的入选菌株。

1.4菌株的形态鉴定及分子鉴定

将筛选到的菌株梯度稀释后,在PDA培养基上涂布,获得单菌落。进行革兰氏染色初步确定菌株的特性并进行显微观察。

16S rDNA基因的PCR引物 上游引物 F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3),下游引物R(5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)。PCR扩增反应体系:0.25 μL Taq DNA聚合酶,5 μL 10×PCR反应缓冲液,4 μL dNTP,1 μL Primer F(上游引物),1 μL Primer R(下游引物),1 μL模板DNA,ddH2O补足50 μL。PCR反应条件:94 ℃变性3 min后进入循环;94 ℃变性45 s;55 ℃退火45 s,72 ℃ 延伸90 s,30个循环后72 ℃终延伸5 min。PCR扩增产物委托上海生工生物工程技术有限公司进行基因测序。

1.5回复性发酵实验

称量生大蒜600 g加入600 mL无菌水置于无菌料理机中打成匀浆液,定容到1200 mL,制成生蒜汁,均分成4份,每份3个平行,装入500 mL三角瓶中;将生蒜在80～100 ℃水中煮15 min,其他步骤同生蒜汁制法;大蒜去皮后用无菌水清洗蒜瓣,置于250 mL烧杯中,备用。

将入选的2株优良大蒜内生菌用PDA液体培养基扩大培养后,按1∶1比例混合,以3%接种量接种于生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣中,扎好瓶口。生蒜汁和熟蒜汁瓶置于42 ℃振荡培养箱培养4 h后,调到50 ℃培养48 h。观察发酵液的颜色、气味、状态的变化情况,测定各样品的活菌数,生蒜瓣于接种7 d后观察颜色变化情况。

2　结果与分析

2.1促进黑蒜发酵菌株的筛选

在加工0、1.8、2.8、4.5、6.2、24、48、72、96、120、144、168、240、288、312、336、360、384 h时间点分别取出蒜瓣样品S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17,进行表面灭菌后,采用平板稀释法进行分离,得到60株内生细菌。这60株菌均分离自S0至S8样品,在S8之后的样品中没有检测到活菌的菌落存在,说明在黑蒜加工过程中样品表面及内部的细菌经过持续反复的高温处理之后基本失去活力,同时也说明从S8样品中筛选到的菌株具有一定的耐高温能力,因此最终选择加工96 h的S8样品中分离到的5株内生细菌作为促进黑蒜发酵的实验菌株。将这5株菌在生蒜汁和熟蒜汁培养基中进行培养,结果见表1。

从表1可知,对两代种子发酵液而言,前3株菌几乎都产碱性物质,发酵液的颜色变化不大,气味欠佳,活菌数的数量级为109,而S8nyzx-1和S8nzm-1可以使蒜汁的颜色变为粉红色,产生令人比较愉悦的酒味,而且活菌数都在1010以上,显著高于前3株菌(p<0.01),发酵液pH略微偏酸,比较符合黑蒜酸甜口感的要求,适合作为黑蒜发酵促进剂的入选菌株。二者相比,S8nyzx-1的菌活力更高一些,是S8nzm-1的3倍,因此选择前者送至上海生工进行16s rDNA测序鉴定。

表1　黑蒜发酵菌两代种子液的培养情况

注:**p<0.01。

2.2促进黑蒜发酵的大蒜内生菌的菌落特征及分子鉴定

2.2.1大蒜内生菌的菌落特征S8nyzx-1菌株在有氧条件下菌落为白色圆形菌落,表面有皱褶(图1)。革兰氏染色阳性,有芽孢,长杆菌(图2),在PDA培养基上产黑色素。在厌氧条件下也可生长,只是生长速度略慢。

图1　S8nyzx-1菌落图片Fig.1　S8nyzx-1 Colony morphology

图2　S8nyzx-1显微图片Fig.2　S8nyzx-1 Microscopy morphology

2.2.2大蒜内生菌的16S rDNA鉴定经上海生工鉴定,促进黑蒜发酵的大蒜内生菌的S8nyzx-1的16S rDNA序列长度为1419 bp(图3),输入Genebank进行同源性序列比较,与其同源性较高的序列均属于Bacillus subtilis subsp. subtilis 菌属,同源性在99.8%的菌株有8株,基本可以确定S8nyzx-1菌株为枯草芽孢杆菌的亚种。

表2　S8nyzx-1菌株16S rDNA序列Blast结果

图3　16S rDNA扩增产物电泳图Fig.3　Eletrophoresis of amplification products of 16S Rdna注:M为Mark的条带图;1和2均为菌株S8nyzx-1的条带图。

2.3大蒜发酵菌剂的回复性发酵实验结果

图4　几种菌液对不同状态培养基的发酵情况比较Fig.4　Fermentation case of Several bacilli in different mediaa.生蒜瓣发酵空白对照；b. S8nzm-1生蒜瓣发酵；c. S8nyzx-1菌生蒜瓣发酵；d.混合菌生蒜瓣发酵；e.生蒜汁空白发酵液；f.熟蒜汁空白发酵液；g. S8nyzx-1菌生蒜汁发酵液；h. S8nyzx-1菌熟蒜汁发酵液；i. S8nzm-1菌生蒜汁发酵液；j.S8nzm-1熟蒜汁发酵液；k.混合菌生蒜汁发酵液；l.混合菌熟蒜汁发酵液。

从表3和图4可知,与空白对照相比,接种培养48 h后,2株参试菌对生蒜汁和熟蒜汁在颜色上没有区别;在口感上处理组及熟蒜汁空白对照均为淡甜味,没有蒜辣味,只是生蒜汁空白对照未产生甜味,仍有蒜辣味;在状态上处理组均为粘度降低、液化趋势,而空白对照虽然也有液化趋势,但是粘度没有变化。与其他1株参试内生菌相比,S8nyzx-1菌株对生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣的发酵效果在感官上基本相似,但是就活菌数而言,在生蒜汁中是另1株菌的6倍,在熟蒜汁中是另1株菌的近20倍。

在对生蒜瓣发酵实验中,接种48 h后,2株菌分别单独处理时只是使蒜变为褐黑色,混合菌在50 ℃条件下发酵7 d蒜瓣可全部变成黑色(图3)。无论是单菌还是混合菌都只是使蒜瓣具有淡甜味,必须经过93 ℃高温处理15 h后才能达到黑蒜成品的真正甜味和软度。而空白对照在口感上无甜味、有辣味,经过93 ℃高温处理15 h后也未变甜,虽然在状态上变软,但只是变为黄褐色,并没有变为黑色(注:此处数据来源于表3)。

表3　不同黑蒜发酵菌株的回复性发酵实验结果

注:*p<0.05,**p<0.01。

3　讨论

本实验以黑蒜加工过程中不同时期的蒜瓣为样本进行了大蒜内生菌的分离研究,结果获得了60株内生菌,经过耐高温及在色泽和口感等方面表现的筛选获得2株对黑蒜发酵有促进作用的细菌,其中以S8nyzx-1菌株表现最佳,经上海生工鉴定,该菌株的16s rDNA序列长度为1419 bp,与Bacillus subtilis subsp. subtilis的同源性为99.8%,基本可以确定S8nyzx-1菌株为枯草芽孢杆菌。将S8nyzx-1等2株菌进行黑蒜发酵回接实验,可使大蒜瓣在较低的温度下(50 ℃)经48 h变成黑色,比原有工艺的96 h缩短了一半的时间。本实验筛选得到的菌株S8nyzx-1和S8nzm-1来自于大蒜蒜瓣自身,而且贯穿于黑蒜的自发酵过程,是大蒜的自有内生菌种,其生物安全性值得信赖,可以将其作为黑蒜生产发酵促进剂进行研究和使用。

本实验所分离获得的内生菌菌株均来自于黑蒜加工的最初96 h之内,这说明齿变式加热生产黑蒜的工艺[8]对内生菌的生长有一定的帮助,反复的升温和降温过程使得具有一定耐高温能力的内生菌得以存活生长,也正是这些细菌的生长对大蒜的变黑起到了积极的促进作用。同时经过持续的反复升降温处理之后大蒜表面及内部的细菌基本失活,保证了黑蒜的食品安全性。

实验还发现将S8nyzx-1菌单独或者与其他菌株混合接种到生蒜瓣上在较低的温度下(50 ℃)虽然可以加速蒜瓣变黑,但是却无法获得成品黑蒜所具有的甜味,只有在经过高温(93 ℃)处理15 h之后才具有成品黑蒜的甜味。这说明S8nyzx-1菌株在生长繁殖过程中,只具有产黑色素的功能,不具有使多糖等物质分解为单糖的能力。

[1]杨瑞先,葛晓燕.植物内生细菌生物学作用研究进展及应用前景[J].洛阳大学学报,2006,21(4):78-81.

[2]Kleopper J.W.,Schippers B,Bakker PAHM. Proposed elimination of the term endorhizosphere[J].Phytopathology,1992,82(7):726-727.

[3]李娜.大蒜的功效成分及其应用的研究进展[J].中国食物与营养,2007,11:25-27.

[4]闫淼淼,许真,徐蝉等.大蒜功能成分研究进展[J].食品科学,2010,31(5):312-318

[5]王玉荣,曲田丽,高敏等.黑蒜的简易制备及其抗氧化活性的测定[J].食品科技,2014,39(1):268-271.

[6]罗仓学,苏东霞,陈树雨.液态黑蒜发酵工艺优化[J].农业工程学报,2013,29(18):292-296.

[7]安东.黑蒜加工工艺的研究[D].山东(泰安):山东农业大学,2011.

[8]姬妍茹,石杰,刘宇峰等.黑蒜生产过程中主要营养成分变化分析及工艺优化[J].食品工业科技,2015,36(5):360-364.

Separation and identification of endophytic bacteria strains and its increase effect in the production process of black garlic

JI Yan-ru1,SHI Jie1,WANG Yue-ming1,2,LIU Yu-feng1,*,DONG Yan1，YANG Qing-li1，ZHANG Zheng-hai1,3，LIU Yu1

(1.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences,Daqing 163319,China;2.College of Food Science,Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China;3.College of Life Science Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

One endophytic bacillus bacteria from different time of Garlic cloves production was isolated and identified. The strain was identified by morphological characteristics and 16S-rDNA sequence alignment. It was Bacillus subtilis with the characteristics of vigorous growth,melanin production and high temperature resistance. At 50 ℃,the raw garlic cloves which inoculated with the bacteria turned black after 48 h,those not inoculated became yellowish only. The strain has some help to the process of raw garlic changing into black garlic. The results can provide supporting data for the research of black garlic formation mechanism,and made the contribution to further development of black garlic fermented bacteria agent.

endophytic bacteria;black garlic;Bacillus subtilis;fermentation promotion

2015-04-09

姬妍茹(1971-),女,硕士,副研究员,研究方向:食品微生物及生物技术,E-mail:jyr309@sohu.com。

刘宇峰(1963-),女,学士,研究员级高工,研究方向:功能食品及益生菌研究,E-mail:lyf5558@yahoo.com.cn。

大庆市科学技术局创新能力建设项目(SCX2010-07);省财政基本科研业务费专项项目(cz10G01)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000