乙酸异戊酯高产菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表达研究

谭才邓,朱美娟,廖延智,朱晓立

(广东轻工职业技术学院,广东广州 510300)



乙酸异戊酯高产菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表达研究

谭才邓,朱美娟,廖延智,朱晓立*

(广东轻工职业技术学院,广东广州 510300)

通过PCR扩增了乙酸异戊酯高产菌Loq-c的脂肪酶基因Lip2,其序列与Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列号X64704.1)的序列相似度最高,为89%。构建原核表达载体pQE-lip2,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),获得了重组菌BL21(pQE-lip2)。经过表达条件探索,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,脂肪酶Lip2原核可溶表达最佳条件为:诱导温度30 ℃,IPTG使用浓度为1.5 mmol/L,150 r/min转速的条件下诱导表达5 h。

乙酸异戊酯,脂肪酶,克隆,表达

酯类化合物是发酵食品的重要香气成分之一,酵母菌是在发酵食品中合成酯类物质的重要微生物。酵母菌合成酯类化合物的途径主要有三个:酯化反应、醇解反应和脱氢反应[1]。酯化反应是合成酯类化合物的主要途径,其催化反应的酶类为脂肪酶,因此脂肪酶被广泛应用于食品加工及食品风味改良。此外脂肪酶在油脂工业、洗涤工业、化妆品工业及生物能源等方面应用广泛[1-5]。近年来,在医药工业中,脂肪酶因能被用于手性制备光学纯的药物而倍加瞩目[3]。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)有多个同工酶,Longhi[6]等研究发现柱状假丝酵母(Candidacylindracea)有5个脂肪酶同工酶;Fickers[7]等研究解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)时,发现菌株E150能编码合成16个脂肪酶同工酶,而分泌到胞外的脂肪酶主要是Lip2,并且Lip2偏好催化合成短链酯类。

菌株Loq-c是本实验室分离获得的一株高产乙酸异戊酯的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。本实验参考前人的结果设计多个脂肪酶引物,通过PCR反应试探菌株Loq-c是否有脂肪酶,是否通过脂肪酶合成乙酸异戊酯,并将其克隆及进行原核表达研究,为生物高效合成乙酸异戊酯提供有价值的参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1质粒与菌种质粒为pQE30;乙酸异戊酯生产菌Loq-c,克隆菌株E.coliDH5α,表达菌株E.coliBL21(DE3)。以上材料均由本实验室提供。

1.1.2试剂药品Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购于上海生工生物工程公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase购于宝生物工程(大连)有限公司;其它试剂均为国产分析纯药品。

1.1.3仪器SHP-150生化培养箱上海精宏实验设备有限公司;ZWY-240摇床上海智诚分析仪器制造有限公司;SC-3614高容量低速离心机安徽中科中佳科学仪器公司;1-14高速离心机Sigma;EasyCycler96PCR仪德国耶拿分析仪器股份公司;电泳仪Mini-PROTEAN、Mini-Sub cell GT,BIO-RAD;电穿孔仪MicroPulser,BIO-RAD;XO-150超声细胞波破碎仪南京先欧仪器制造公司。

1.1.4引物

表1　脂肪酶PCR扩增引物

注:引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2实验方法

1.2.1菌株Loq-c粗酶的制备将50 mL菌株Loq-c发酵液经3000 r/min离心5 min,菌体沉淀用5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)悬浮,于研钵中添加适量石英砂研磨破碎5 min,3000 r/min离心5 min,上清液即为粗酶液,置于4 ℃冰箱中保存,12 h内使用。

1.2.2菌株Loq-c粗酶中酯类合成酶的定性分析酵母菌合成酯类化合物关键酶主要有3类,分别为脂肪酶(R1COOH+R2OH →R1COOR2+H2O)、醇酰基转移酶(R1OH+R2COSCoA →R2COOR1+CoASH)和醇脱氢酶(R1OCH(OH)R2+NAD(P)+→R2COOR1+NADH+H+),其中脂肪酶是主要的酯类合成酶[1,3]。根据其底物的不同,本实验对菌株Loq-c粗酶中是否含有脂肪酶进行定性实验,将10 mL菌株Loq-c粗酶液置于50 mL三角瓶中,加入0.1 mL乙酸,0.1 mL异戊醇,用封口膜封口,于摇床中30 ℃、120 r/min振荡反应2 h(同时做对照实验),由于产物乙酸异戊酯的气味(香蕉味)特殊,其浓度在1 μL/L时可明显辨别,因此通过气味感官评定判断是否产生乙酸异戊酯。

1.2.3酵母基因组NDA提取根据Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒操作说明书进行,总DNA于-20 ℃保存备用,用于PCR反应扩增脂肪酶基因片段。

1.2.4PCR扩增初步确定脂肪酶同工酶种类PCR反应体系:5×PrimeSTAR 缓冲液10 μL,dNTP混合液(每种2.5 mmol/L)5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板1 μL,PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,补水至50 μL。

PCR反应程序:96 ℃预变性4 min;96 ℃变性20 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,32个循环;72 ℃延伸5 min,并用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。

1.2.5脂肪酶Lip2基因的克隆与表达载体的构建PCR反应体系与反应程序同1.2.4,引物重新设计:上游引物(cgcggatccatgaagctctgtttgcttgctcttggtgct,酶切位点为Bam HI),下游引物(cccaagctttactacacaaa gaacagtggcgggttggaa,酶切位点为Hind Ⅲ)。PCR产物经纯化后,用内切酶Bam HI与Hind Ⅲ进行双酶切,同时对质粒pQE30进行双酶切。酶切产物经纯化后,用T4连接酶进行连接。连接产物电击转化大肠杆菌DH5α。

1.2.6脂肪酶Lip2基因序列比对分析与原核表达分析挑取阳性转化菌株,摇菌提取重组质粒送至上海生工生物工程公司进行测序,所得序列在NCBI网站上进行比对分析。重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)后,从诱导时间、诱导温度、诱导物IPTG浓度等条件对脂肪酶Lip2进行原核表达分析。

1.2.7诱导时间对脂肪酶Lip2可溶表达的影响分析在诱导温度30 ℃,IPTG浓度1 mmol/L,转速150 r/min的条件下,诱导表达时间设定在0～24 h,同时以含空载体pQE30的表达菌株进行对照实验。离心取等量的菌体分别进行超声波破碎,经13000 r/min离心10 min后取上清液,进行SDS-PAGE分析表达情况。

1.2.8诱导温度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响分析在最佳诱导时间,IPTG浓度1 mmol/L,转速150 r/min的条件下,诱导表达温度分别设定在24～40 ℃之间。同1.2.7,用SDS-PAGE方法进行表达情况分析。

1.2.9诱导物IPTG浓度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响分析在最佳诱导时间,在最佳诱导温度,转速150 r/min的条件下,诱导物IPTG使用浓度设定在0.2～4.0 mmol/L之间。同1.2.7,用SDS-PAGE方法进行表达情况分析。

2　结果与分析

2.1菌株Loq-c粗酶中酯类合成酶的定性分析

通过定性实验及感官评定:含有粗酶液与底物的反应瓶中明显闻到乙酸异戊酯的味道,而只有粗酶液或只有底物的对照瓶中没有闻到乙酸异戊酯的味道,因此可判断菌株Loq-c中催化合成乙酸异戊酯的酶类中有脂肪酶。

2.2菌株Loq-c脂肪酶同工酶种类的初步分析

根据Longhi[6]等的研究结果,分别设计5个脂肪酶同工酶引物,以Loq-c基因组DNA为模板进行PCR反应扩增脂肪酶基因片段,PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1。

图1　菌株Loq-c脂肪酶PCR扩增产物电泳图Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of Lipase PCR products of strain Loq-c注:M-marker DS2000;泳道1～5:引物分别为Lip1、Lip2、Lip3、Lip4、Lip5的PCR产物。

从图1可知,Lip2引物对扩增出条带,在1.0～2.0 kbp有明显条带,与目标片段1.6 kbp吻合,而其它引物对则没有扩增出相应的条带,可认为菌株Loq-c催化合成乙酸异戊酯的酶类有脂肪酶Lip2。

2.3脂肪酶Lip2基因的克隆与表达载体的构建

根据表达载体pQE30的多克隆位点重新设计引物进行PCR反应扩增Lip2基因片段,PCR产物与质粒pQE30分别进行双酶切后进行连接,连接产物电击转化克隆菌株DH5α,重组质粒命名为pQE-lip2。重组质粒经测序,所得序列在NCBI网站进行比对分析,结果显示,其序列与Gene Bank中的CandidacylindraceaLip2 gene(序列号X64704.1)的序列相似度最高,为89%,表明菌株Loq-c脂肪酶Lip2基因克隆成功。将重组质粒pQE-lip2转化到表达菌株BL21(DE3)中,对其表达进行分析研究。

2.4Loq-c脂肪酶Lip2原核可溶表达分析

为了探讨脂肪酶Lip2在大肠杆菌中能否以可溶的形式进行表达,从诱导时间、诱导温度、诱导物IPTG浓度这几方面进行单因素探索,结果如下:

2.4.1诱导时间对脂肪酶Lip2可溶表达的影响诱导时间对重组蛋白可溶表达的影响结果见图2。

图2　诱导时间对脂肪酶Lip2可溶表达的影响Fig.2　Effect of induced time on soluble expression of Lipase 2注:1:pQE30;2:0 h;3:1 h;4:2 h;5:3 h;6:5 h;7:10 h;8:15 h;9:24 h。

由图2可知,含空载体pQE30的表达菌株经过24 h的诱导,并没表达出目的蛋白(泳道1)。重组质粒pQE-lip2在0～24 h的表达情况如下:0 h时没表达出目的蛋白(泳道2),从1 h开始,上清液中在44～66 ku之间有明显条带,与目标片段58 ku吻合(箭头处),进一步表明Liq2基因克隆成功,并且脂肪酶Lip2在大肠杆菌中能以可溶形式进行表达。从图中可看出,脂肪酶Lip2在第5 h(泳道6)时表达量达到最高值,往后延长表达时间并没有再提高目的蛋白表达量,因此可认为脂肪酶Lip2可溶表达最佳诱导时间为5 h。

2.4.2诱导温度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响诱导温度对重组蛋白可溶表达的影响结果见图3。

图3　诱导温度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响Fig.3　Effect of induced temperature on soluble expression of Lipase 2注:1:24 ℃;2:26 ℃;3:28 ℃;4:30 ℃;5:32 ℃;6:34 ℃;7:36 ℃;8:38 ℃;9:40 ℃。

由图3可知,诱导表达温度在30 ℃时,目的蛋白条带最浓(泳道4),说明在此温度Lip2可溶表达量最高。当温度低于30 ℃时细胞生命活动速率较慢,目的蛋白表达量较低;当温度高于32 ℃时,目的蛋白可能转向以包涵体的形式进行表达,导致可溶表达量不再提高。因此可认为Lip2可溶表达最佳诱导温度为30 ℃。

2.4.3诱导物IPTG使用浓度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响诱导物IPTG使用浓度对重组蛋白可溶表达的影响结果见图4。

图4　诱导物IPTG使用浓度对脂肪酶Lip2可溶表达的影响Fig.4　Effect of concentration of IPTG on soluble expression of Lipase 2注:1:0.2 mmol/L;2:0.5 mmol/L;3:1.0 mmol/L;4:1.5 mmol/L;5:2.0 mmol/L;6:2.5 mmol/L;7:3.0 mmol/L;8:3.5 mmol/L;9:4.0 mmol/L。

由图4可知,当IPTG浓度在1.5 mmol/L以内时,Lip2可溶表达量随着IPTG浓度的提高而升高,并在1.5 mmol/L时达到最高,继续提高IPTG浓度并没能提高Lip2的可溶表达量,可能较高浓度IPTG的作用下Lip2转向包涵体形式进行表达。因此可认为Lip2可溶表达最佳IPTG使用浓度为1.5 mmol/L。

3　结论与展望

本实验成功克隆获得乙酸异戊酯高产菌株Loq-c的脂肪酶Lip2基因,其序列与Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列号X64704.1)的序列相似度最高,为89%。构建原核表达载体pQE-lip2并进行原核可溶表达实验,实验结果表明:脂肪酶Lip2在大肠杆菌中能以可溶形式进行表达,其可溶表达的最佳条件为:诱导温度30 ℃,IPTG使用浓度为1.5 mmol/L,150 r/min转速的条件下诱导表达5 h。

目前,对目的酶基因进行异源高效表达是获得高活力酶的一种最直接、高效、便捷的方式,当然,由于糖基化、蛋白质折叠等翻译后修饰的不同,会导致一些异源表达的蛋白不具备其本身具有的活性,因此可溶活性表达非常重要。目前异源表达系统大致可分为原核表达与真核表达,原核表达系统与真核表达系统相比,有其自身的优点:譬如培养条件简单,成本低,后继纯化工作简单等,因此本实验以原核表达的方式进行外源表达脂肪酶Lip2基因。本研究的后续工作应在脂肪酶Lip2的分离纯化与活性研究方面展开,为生物高效合成乙酸异戊酯提供有价值的参考。

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Study on the cloning and prokaryotic soluble expression of Lipase geneLip2 of high-yield isoamyl acetate strain

TAN Cai-deng,ZHU Mei-juan,LIAO Yan-zhi,ZHU Xiao-li*

(Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China)

The gene encoding Lipase2(Lip2)from high-yield isoamyl acetate strain Loq-c was amplified by polymerase chain reaction(PCR),its sequence was most similar to Candida cylindracea Lip2 gene(X64704.1),the similarity was 89%. Subsequently,the corresponding expression vector pQE-lip2 was constructed and cloned intoE.coliBL21(DE3),resulting in recombinant strain BL21(pQE-lip2). After explorations,SDS-PAGE analysis showed that the best conditions for soluble expression of Lip2 was:30 ℃,IPTG 1.5 mmol/L,150 r/min,induced for 5 hours.

Isoamyl acetate;Lipase;clone;express

2015-05-19

谭才邓(1980-)，男，硕士，高级实验师，研究方向：食品与生物技术，E-mail：tcdeng@126.com。

朱晓立(1980-)，男，硕士，副教授，研究方向：食品与生物技术，E-mail：zxl800101@126.com。

广东省高等学校优秀青年教师培养计划资助项目(Yq2013166)；广东轻工职业技术学院自然科学基金重点项目(KJ201308)；广东轻工职业技术学院创新强校重大科研项目培养计划(1A20205)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000